張雲(yún)喬， 王 勝， 劉艷杰， 崔 爽， 曲 適， 王鑫鑫， 龍 嘯， 方 芳， 郝 峰

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)檢驗(yàn)教研室， 吉林吉林132013 ； 2.吉林省腫瘤醫(yī)院， 吉林長春130021 ；3.吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院， 吉林吉林132013 ； 4.重慶探生科技有限公司， 重慶九龍坡400039)

鈣激活氯通道蛋白ANO1在小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的表達(dá)及其功能鑒定

張雲(yún)喬1， 王 勝2， 劉艷杰3， 崔 爽1， 曲 適1， 王鑫鑫1， 龍 嘯4， 方 芳1， 郝 峰1

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)檢驗(yàn)教研室， 吉林吉林132013 ； 2.吉林省腫瘤醫(yī)院， 吉林長春130021 ；3.吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院， 吉林吉林132013 ； 4.重慶探生科技有限公司， 重慶九龍坡400039)

探討鈣激活氯通道蛋白ANO1在C57BL/6小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)及其功能特性。運(yùn)用膠原酶消化法獲得原代培養(yǎng)的小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測平滑肌細(xì)胞純度；應(yīng)用RT-PCR檢測主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞ANO1 mRNA的表達(dá)；免疫印跡檢測ANO1蛋白在主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的表達(dá)情況；應(yīng)用熒光淬滅動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測ANO1鈣激活氯通道的功能特性。原代培養(yǎng)成功獲得主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；RT-PCR結(jié)果分析表明，主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在mRNA水平有ANO1表達(dá)；免疫印跡顯示主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞蛋白水平有ANO1表達(dá)；熒光淬滅動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)表達(dá)在主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的ANO1具有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能，即鈣激活氯通道典型特性。小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表達(dá)的ANO1是鈣激活氯通道的分子基礎(chǔ)。

ANO1蛋白；鈣激活氯離子通道；小鼠；主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞

高血壓是心腦血管疾病的第一危險(xiǎn)因素。血管平滑肌細(xì)胞上的離子通道是血管正常收縮舒張來維持血壓的重要因素[1]。Cl-是細(xì)胞外液主要陰離子，通過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和陰離子通道蛋白參與多種生理功能。目前研究發(fā)現(xiàn)Anoctamin-1 ( ANOl ) 能夠編碼CaCCs[2～4]。因此以小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞作為研究對(duì)象，應(yīng)用分子生物學(xué)、免疫熒光化學(xué)方法以及熒光淬滅動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，明確ANOl 在主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的表達(dá)，為深入研究該通道功能、明確該通道與高血壓的發(fā)病機(jī)制及靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 C57BL/6小鼠由吉林大學(xué)第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。兔抗鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)單克隆抗體，購自BD公司；anti-ANO1單克隆抗體及HRP標(biāo)記羊抗兔IgG，購自SANTA CRUZ公司；ionomycin和T16Ainh-A01，購自Millipore公司；Lipofectamine LTX，購自Invitrogen公司；pcDNA3.1-YFP-H148Q/I152L為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察和鑒定 采用組織塊法與膠原酶消化法聯(lián)合收集主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞[5]，10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)3 d，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測平滑肌細(xì)胞純度。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶聯(lián)反應(yīng)( RT-PCR )檢測AN O1表達(dá) 應(yīng)用TRIZol提取RNA。以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增。參照文獻(xiàn)[4]合成ANO1引物序列：上游5′- GGACCTGGGCTATGAGGTTCAG-3′，下游5′-CAGCGCGTCCCCATGGTACTC-3′。內(nèi)參β-actin 引物序列：上游5′-CATCCTGCGTCTGGACCTG-3′，下游5′-ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3′。RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3 免疫印跡檢測ANO1蛋白的表達(dá) 按照BCA蛋白質(zhì)定量方法測定蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉2 h，加ANO1單克隆抗體(1∶100)4 ℃過夜。漂洗后加入二抗(1∶500)孵育1 h。繼續(xù)洗膜，加入底物室溫孵育 1 min。采集圖像后分析ANO1蛋白的表達(dá)。

1.2.4 熒光淬滅動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)鑒定ANO1功能 96孔板中細(xì)胞數(shù)為20 000/孔，培養(yǎng)24 h。將脂質(zhì)體和pcDNA3.1-YFP-H148Q/I152L加入96孔板，36 h后加入含有5μmol/L ionomycin的高I-溶液，多功能酶標(biāo)儀動(dòng)態(tài)檢測熒光淬滅情況并獲取動(dòng)態(tài)曲線。以ANO1特異抑制劑T16Ainh-A01(10 μmol/L)溶液及不含ionomycin高I-溶液作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分離與培養(yǎng)和鑒定 采用組織塊與膠原酶消化法聯(lián)合，結(jié)果顯示，獲得較多的C57BL/6小鼠原代主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，胞體較小，呈較規(guī)則梭形，貼壁良好，見圖 1。流式細(xì)胞術(shù)檢測上述細(xì)胞表面標(biāo)記分子α-SMA表達(dá)，抗體染色陽性的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)分析平滑肌細(xì)胞比例為98.7%，見中插彩版圖2。

圖1 原代培養(yǎng)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞形態(tài) (×200)

2.2 主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞ANO1的mRNA表達(dá) RT-PCR結(jié)果表明，在400 bp附近出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的目的片段大小相符，見圖3。證實(shí)經(jīng)原代分離培養(yǎng)的小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在mRNA水平上有ANO1穩(wěn)定表達(dá)。

圖3 主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的RT-PCR檢測結(jié)果

2.3 ANO1蛋白在小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的表達(dá) 小鼠ANO1蛋白大小為150 kD，根據(jù)Western-Blot結(jié)果顯示，主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞提取蛋白在分離膠相應(yīng)位置上可見預(yù)期大小的清晰條帶，證明小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在蛋白水平表達(dá)有ANO1，見圖4。

圖4 主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞ANO1蛋白的表達(dá)

2.4 主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞ANO1的功能特性鑒定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入Ionomycin使熒光強(qiáng)度迅速下降(見圖5A)，表明ANO1具有CaCCs內(nèi)向轉(zhuǎn)運(yùn)I-的功能，其激活與鈣離子密切相關(guān)。加入ANO1特異抑制劑，熒光強(qiáng)度無明顯變化，進(jìn)一步明確主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)流的碘是通過ANO1實(shí)現(xiàn)的(見圖5B)。上述結(jié)果一致表明，表達(dá)于ANO1具有鈣激活和轉(zhuǎn)運(yùn)碘離子的特性，符合經(jīng)典CaCCs特性。

圖5 YFP H148Q/I152L鑒定ANO1功能A：穩(wěn)定表達(dá)ANO1的細(xì)胞加入Ionomycin熒光猝滅； B：對(duì)照組

3 討論

研究表明，離子通道與血管張力的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)密切相關(guān)[4]。Cl-通道作為主要的陰離子通道，開放可導(dǎo)致Cl-外流，驅(qū)動(dòng)膜電位向ECl方向靠近，形成膜的去極化從而引起平滑肌的收縮，對(duì)血管收縮反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用。目前研究認(rèn)為，氯通道結(jié)構(gòu)的改變和功能的紊亂可導(dǎo)致原發(fā)性高血壓，因此氯通道將成為高血壓研究領(lǐng)域的新焦點(diǎn)、治療的新靶點(diǎn)。

血管平滑肌細(xì)胞主要存在兩種陰離子通道，即容積調(diào)節(jié)的Cl-通道和Ca2+激活Cl-通道[6-7]。其中 CaCCs可以被細(xì)胞膜電位去極化和細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高所激活，造成平滑肌細(xì)胞收縮，血管張力增大，對(duì)心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展起到重要調(diào)節(jié)作用。但是由于CaCCs的分子基礎(chǔ)長期未得到證實(shí)，導(dǎo)致CaCC的分子結(jié)構(gòu)與功能和疾病之間的關(guān)系等研究都無法深入展開。直到2008年Nature、Science和Cell同時(shí)報(bào)道：CaCCs通道是由ANO1蛋白構(gòu)成[2]，這一發(fā)現(xiàn)為特定細(xì)胞和組織中研究氯離子通道的生理病理相關(guān)問題及其作用機(jī)制提供了新的研究平臺(tái)。本實(shí)驗(yàn)以小鼠原代培養(yǎng)的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞為研究對(duì)象，在mRNA和蛋白水平證實(shí)小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存在 ANO1 的表達(dá)，并應(yīng)用功能試驗(yàn)證實(shí)ANO1 確具有 CaCCs 通道的功能特性。因此，認(rèn)為主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表達(dá)ANO1蛋白，并且發(fā)揮內(nèi)源性 CaCCs作用。本研究結(jié)果為深入探討血管平滑肌細(xì)胞CaCCs在高血壓形成機(jī)制中的作用，及臨床高血壓病的防治研究提供基礎(chǔ)。目前推測CaCCs可能是引起、維持較高血管張力和外周血流阻力的因素之一，阻斷CaCCs通道可引起外周血管舒張，激活CaCCs通道則引起外周血管收縮，CaCCs在外周血管平滑肌細(xì)胞張力的產(chǎn)生、維持及調(diào)節(jié)方面起著重要作用[4]?？傊S著對(duì)CaCCs研究的不斷深入，其生理學(xué)和藥理學(xué)特點(diǎn)及其在動(dòng)脈張力中的作用會(huì)被逐漸揭示，為高血壓等心血管疾病的研究提供新方向和線索。

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2016-03-18

吉林省衛(wèi)生計(jì)生科研計(jì)劃(2014Z103)；吉林省教育廳基金資助(2013-351)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81202031)；2016年吉林醫(yī)藥學(xué)院國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(NO.201613706020)

張雲(yún)喬(1993-)，女，本科，主要從事離子通道的結(jié)構(gòu)和功能研究，E-mail：1017794752@qq.com

郝峰，E-mail:haof863@126.com

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0529-6005(2016)12-0087-02