曹丹丹 ， 路 浩 ， 薛瑞旭 ， 王 歡 ， 權(quán)海云 ， 趙寶玉

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 陜西楊凌712100 ； 2.江蘇省泰州市高港區(qū)農(nóng)業(yè)委員會(huì) ， 江蘇高港225300)

不同培養(yǎng)溫度對(duì)變異黃芪內(nèi)生真菌多樣性的影響

曹丹丹1,2， 路 浩1， 薛瑞旭1， 王 歡1， 權(quán)海云1， 趙寶玉1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 陜西楊凌712100 ； 2.江蘇省泰州市高港區(qū)農(nóng)業(yè)委員會(huì) ， 江蘇高港225300)

為了探討溫度對(duì)變異黃芪內(nèi)生真菌多樣性的影響。對(duì)采集于內(nèi)蒙古騰格里變異黃芪的莖、葉和花，運(yùn)用表面消毒法和尖端菌絲挑取法將組織塊分別置于20 ℃、28 ℃和室溫(變溫)條件下進(jìn)行內(nèi)生真菌分離與純化，采用形態(tài)學(xué)和ITS序列分析技術(shù)進(jìn)行種屬鑒定，并計(jì)算多樣性指數(shù)。504塊組織塊中共分離到內(nèi)生真菌410株，分屬于10科15屬23種，不同溫度下分離到的內(nèi)生真菌有所不同，Undifilumoxytropis為優(yōu)勢(shì)菌屬，且在20 ℃時(shí)優(yōu)勢(shì)更為顯著。多樣性指數(shù)計(jì)算結(jié)果顯示，香農(nóng)-維納指數(shù)(H)為1.85，辛普森指數(shù)(D)為0.269，均勻度指數(shù)(E)為0.59，不同溫度下多樣性指數(shù)不同，28 ℃培養(yǎng)香農(nóng)-維納指數(shù)最高，20 ℃培養(yǎng)辛普森指數(shù)最大。結(jié)果表明，溫度對(duì)內(nèi)生真菌分離率有一定影響，對(duì)Undifilumoxytropis分離率的影響極其顯著，而對(duì)內(nèi)生真菌的多樣性影響也較為明顯。

變異黃芪 ； 溫度 ； 內(nèi)生真菌 ； 多樣性

變異黃芪(Astragalusvariabilis)俗稱碎草、瓜瓜草，是豆科黃芪屬(Astragalus)多年生草本植物，全草有毒，廣泛分布于我國的內(nèi)蒙古、甘肅、新疆、青海、寧夏等地的荒漠及半荒漠地區(qū)，已成為我國沙漠化草地主要優(yōu)勢(shì)植物之一[1-2]。變異黃芪會(huì)造成母畜流產(chǎn)、弱胎、胎兒畸形、發(fā)育不良，公畜精子品質(zhì)下降等，嚴(yán)重影響家畜的生長繁殖，給牧民帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。目前，關(guān)于變異黃芪的研究主要集中在其中毒病研究及防治[5]、毒性成分分離鑒定及利用[6]、產(chǎn)毒機(jī)制[7]、內(nèi)生真菌的分離鑒定及定量檢測[8]等方面。研究表明，培養(yǎng)基、光照對(duì)內(nèi)生真菌的多樣性有較大影響[9]，但未見不同溫度對(duì)變異黃芪內(nèi)生真菌多樣性的影響。本研究以變異黃芪為研究對(duì)象，通過分析不同溫度下分離出的內(nèi)生真菌種屬差異，探討不同溫度對(duì)分離到內(nèi)生真菌多樣性的影響，為進(jìn)一步深入研究變異黃芪毒素合成機(jī)制及與內(nèi)生真菌互作和抗逆性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集地點(diǎn) 本試驗(yàn)所用變異黃芪于2013年5月采自內(nèi)蒙古騰格里，采集后立即放入裝有變色硅膠的自封袋脫水，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L。滅菌后加入雙抗抑制細(xì)菌生長。

1.3 試劑與儀器 75%乙醇、NaClO、氯仿、異戊醇、CTAB提取液、2×EasyTaqPCR Super Mix、10×Loading Buffer以及DNA Marker(TaKaRa)、引物ITS1和ITS4(南京金斯瑞)、PCR產(chǎn)物回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)(Sigma 3K15)、全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(Syngene)。

1.4 內(nèi)生真菌的分離與純化 將變異黃芪的莖、葉和花用滅菌蒸餾水沖洗干凈，無菌濾紙吸干表面水分，75%乙醇漂洗30 s，無菌水沖洗3次，有效氯為2%的NaClO漂洗3 min，無菌水沖洗后，再將組織剪成小塊，置于培養(yǎng)基中，于20 ℃、28 ℃和室溫下培養(yǎng)，挑取頂端菌絲置于新培養(yǎng)基上，純化保藏于 4 ℃ 冰箱。

為檢查表面消毒是否徹底，做漂洗液檢測和組織印記檢測，如果兩種檢測方法培養(yǎng)基上均無任何菌生長，證明表面消毒效果良好，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 內(nèi)生真菌種屬鑒定及多樣性分析

1.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定 挑取已純化菌株的尖端菌絲接種于培養(yǎng)基，定期觀察其菌落形態(tài)、顏色、大小等特征。用無菌蓋玻片以45°插入培養(yǎng)基，待菌絲爬片之后，觀察其孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征，參照真菌鑒定手冊(cè)對(duì)其進(jìn)行初步鑒定[10]。

1.5.2 rDNA-ITS序列分析鑒定 改良CTAB法提取菌絲DNA，采用真菌rDNA擴(kuò)增的通用引物ITS 1和ITS 4擴(kuò)增其5.8S rDNA-ITS保守序列，將目的片段回收純化測序。

2 結(jié)果

2.1 不同溫度對(duì)分離內(nèi)生真菌種類及分離率的影響 本試驗(yàn)分離到內(nèi)生真菌410株，不同溫度下莖、葉和花中分離出內(nèi)生真菌種屬見表1，分離率見表1。

表1 不同溫度下內(nèi)生真菌分離種類比較

2.2 不同溫度培養(yǎng)對(duì)優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌的影響 由表2可知，不同溫度下分離出的內(nèi)生真菌并不相同，但均分離到U.oxytropis，T.microspore，T.subthermophila，T.basicola，Sordarialessp.和Xylariasp.并且這幾種內(nèi)生真菌的分離率有明顯差異(見圖1)，尤其是對(duì)U.oxytropis，在20 ℃時(shí)，其他幾種內(nèi)生真菌的生長被顯著抑制，而U.oxytropis的分離率顯著提高。

表2 不同溫度下內(nèi)生真菌分離率和物種豐富度指數(shù)比較

圖1 不同溫度下優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌所占比例

2.3 內(nèi)生真菌多樣性分析比較 香農(nóng)-維納指數(shù)、辛普森多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)，見表3，與國內(nèi)甘肅棘豆相比，內(nèi)蒙古騰格里蘇木變異黃芪內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)整體偏低[9]。

表3 不同溫度下變異黃芪內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)比較

3 討論

本試驗(yàn)中，室溫時(shí)內(nèi)生真菌的分離率最高(表2)，且種類最多(表1)。在20 ℃時(shí)，其他內(nèi)生真菌的生長受到明顯抑制，而U.oxytropis的分離率明顯提高。這可能是由于其他內(nèi)生真菌多為快生型，而U.oxytropis為慢生型，在通常條件下，快生型的內(nèi)生真菌往往抑制慢生型內(nèi)生真菌的生長，而在溫度較低時(shí)，快生型內(nèi)生真菌的生長受到明顯抑制，因而提高了慢生型內(nèi)生真菌的分離率。因此，在選擇性分離U.oxytropis時(shí)，20 ℃為首選，而在研究內(nèi)生真菌多樣性方面，室溫培養(yǎng)較為適宜。

U.oxytropis為本次試驗(yàn)分離到的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，在3種培養(yǎng)溫度下其分離率均較高，在20 ℃時(shí)優(yōu)勢(shì)尤其明顯。本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)ITS序列分析鑒定為U.oxytropis的菌株具有不同的形態(tài)特征(見圖2)，這可能是表觀遺傳的作用。

圖2 U. oxytropis菌落形態(tài)

本試驗(yàn)中，整體香農(nóng)-維納指數(shù)為1.85，辛普森指數(shù)為0.269，均勻度指數(shù)為0.59。在28 ℃時(shí)，香農(nóng)-維納指數(shù)最高，在20 ℃時(shí)，辛普森指數(shù)最高。28 ℃和室溫下，均勻度指數(shù)相似，所以香農(nóng)-維納指數(shù)也相似，但辛普森指數(shù)差別較大可能是由于內(nèi)生真菌的種類數(shù)目差異較大。在20 ℃時(shí)，U.oxytropis具有極高的分離率，導(dǎo)致其他內(nèi)生真菌的分離率明顯降低，雖然內(nèi)生真菌的種類與其他兩種溫度下無較大差異，但是數(shù)量過多集中于U.oxytropis，因而，在20 ℃時(shí)，香農(nóng)-維納指數(shù)、辛普森指數(shù)以及均勻度指數(shù)都最低。

本研究首次就不同溫度對(duì)變異黃芪內(nèi)生真菌多樣性的影響進(jìn)行探討，可為今后選擇性分離U.oxytropis提供一定試驗(yàn)依據(jù)，也為進(jìn)一步闡明我國變異黃芪內(nèi)生真菌種群分布特征及遺傳多樣性奠定基礎(chǔ)。

[1] 趙寶玉,劉忠艷,萬學(xué)攀,等.中國西部草地毒草危害及治理對(duì)策[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,41(10):3094-3103.

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[10] 魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1979.

Effect of Different Culturing Temperature on Isolation and Diversity of Fungal Endophyte in Astragalus variabilis

CAO Dan-dan1,2， LU Hao1， XUE Rui-xu1， WANG Huan1， QUAN Hai-yun1， ZHAO Bao-yu1

(1.College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling 712100, China ; 2.Agriculture Committee of Taizhou high port area, Jiangsu, Gaogang 225300,China)

To ascertain the effect of different temperature on diversity of fungal endophyte fromAstragalusvariabilis, andAstragalusvariabilissamples in Tengeli County of Inner Mongolia were collected.The method of surface disinfection was used to isolate and purify the fungal endophyte in stems, leaves and flowers.And then morphology techniques and ITS sequence analysis were used to identify the species, and the diversity index was calculated.The results showed that 410 fungal endophyte were isolated from 504 samples, which included 23 kinds of fungal endophytes.There were different kinds of fungal endophyte under different temperature, andUndifilumoxytropiswas the dominant strain, especially at 20 ℃.The Shannon-Weiner index was 1.85, Simpson diversity index was 0.269, and evenness index was 0.59.The diversity index was different in different temperature.The Shannon-Weiner index was biggest in 28 ℃, and simpson diversity index was the biggest in 20 ℃.The results show that the influence of temperature to isolation rate of fungal endophyte is not significant, but the isolation rate ofUndifilumoxytropisand diversity of fungal endophyte is significant.

Astragalusvariabilis, Temperature, Endophytic fungi , Diversity

LU Hao

2014-12-17

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201958)；國家“十二五”公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203062)

曹丹丹(1988-)，女，碩士，主要從事瘋草內(nèi)生真菌研究，E-mail:cdd1988228@163.com

路浩，E-mail:luhao@nwsuaf.edu.cn

S859.87

A

0529-6005(2016)12-0041-03