王彩云， 張召議， 張子英,3， 關(guān) 紅， 李培鋒

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院， 內(nèi)蒙古呼和浩特010018； 2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特010018； 3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 內(nèi)蒙古呼和浩特010110)

?；悄懰釋?duì)LPS誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞分泌IL-1β的調(diào)節(jié)作用

王彩云1,2， 張召議1,2， 張子英1,2,3， 關(guān) 紅1,2， 李培鋒1,2

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院， 內(nèi)蒙古呼和浩特010018； 2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特010018； 3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 內(nèi)蒙古呼和浩特010110)

為研究牛磺膽酸(Taurocholic Acid,TCA)對(duì)NR8383細(xì)胞分泌的白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的影響,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)了TCA對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞分泌IL-1β mRNA和蛋白含量的影響。結(jié)果顯示，脂多糖(LPS)極顯著增加IL-1β mRNA和蛋白含量(P<0.01)；1 000μmol/L TCA可降低LPS誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞分泌IL-1β mRNA和蛋白含量；500μmol/L、100μmol/L的TCA可極顯著降低LPS誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞分泌IL-1β mRNA和蛋白含量(P<0.01)。結(jié)論： TCA可降低經(jīng)LPS誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞分泌IL-1β基因、蛋白水平含量，隨著劑量的降低呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性的抑制作用，表明TCA具有抗炎免疫調(diào)節(jié)作用。

牛磺膽酸； NR8383細(xì)胞； 白介素-1β； 調(diào)節(jié)作用

?；悄懰?TCA)是一種由膽酸的羧基與?；撬岬陌被怎０锋I結(jié)合的初級(jí)膽汁酸，其分子式為C23(OH)3H36CONHCH2CH2SO3H，它具有利膽、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[1]。研究表明，TCA對(duì)急性、亞急性和慢性增生性炎癥均有顯著的抑制作用，作用機(jī)理與其抑制炎性組織中的PGE2、抑制NO和組胺的合成釋放量有關(guān)[2]。致炎劑LPS通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞激活ERK途經(jīng)參與IL-1β等基因的表達(dá)，刺激巨噬細(xì)胞發(fā)生炎性反應(yīng)[3]，上述資料為T(mén)CA參與細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)提供了參考依據(jù)。本研究以大鼠肺泡巨噬細(xì)胞(NR8383細(xì)胞)為靶細(xì)胞，在LPS誘導(dǎo)后通過(guò)不同劑量的TCA作用，以NR8383細(xì)胞分泌IL-1β的mRNA和蛋白表達(dá)為切入點(diǎn)，揭示TCA的抗炎免疫作用及其分子作用機(jī)制，為高效利用TCA提供分子研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 DMEM高糖培養(yǎng)基(C119955 00BT，Gibco公司)；0.05%的Trypsin-EDTA(25300-054，Gibco公司)；RNAiso Plus(批號(hào)：9109，TaKaRa公司)；SYBR?Prime ExTaqTWⅡ(批號(hào)：DRR041A，TaKaRa公司)；Prime Script? RTMaster Mix(批號(hào)：RR036A，TaKaRa公司)；IL-1β ELISA試劑盒(上海依科賽公司)；TCA(T0216，SIGMA公司)；多功能酶標(biāo)儀(Synergy 4，美國(guó)Bio-Tek)，低溫高速離心機(jī)(Sigma-3-30K)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 本試驗(yàn)使用NR8383細(xì)胞(大鼠肺泡巨噬細(xì)胞)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)，使用0.05%胰酶進(jìn)行消化并傳代。

1.2.2 RT-qPCR法 用TRIZol提取NR8383細(xì)胞中的總RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：500 ng總RNA、2 μL MIX(dT)，無(wú)酶水補(bǔ)齊至10 μL，得到cDNA。PCR反應(yīng)體系如下：模板2 μL、上游引物和下游引物各為1 μL、12.5 μL的SYBRPrime ExTaqTWⅡ，補(bǔ)水到25 μL，每個(gè)樣品6個(gè)重復(fù)；用2-(ΔCt)公式計(jì)算IL-1β基因的相對(duì)表達(dá)量。其中β-actin和IL-1β的引物序列見(jiàn)表1。

表1 β-actin、IL-1β的引物序列

1.2.3 ELISA 檢測(cè)經(jīng)處理后的NR8383細(xì)胞的IL-1β含量 取經(jīng)過(guò)TCA和LPS處理后的NR8383細(xì)胞上清液100 μL、生物素化抗體50 μL均加入ELISA板孔中，在37 ℃條件下孵育150 min，洗板以后加入100 μL的酶工作液，在37 ℃條件下避光孵育30 min，再次洗板以后加入100 μL顯色底物，37 ℃ 孵育15 min，最后再加入終止液100 μL，10 min內(nèi)在OD450處檢測(cè)吸光值。標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別是1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.3125 pg/mL和0 pg/mL。

1.3 試驗(yàn)分組 不同濃度TCA對(duì)經(jīng)LPS作用后NR8383細(xì)胞的IL-1β mRNA和蛋白含量影響的分組如表2所示。

表2 濃度梯度TCA對(duì)經(jīng)LPS作用后NR8383細(xì)胞的IL-1β含量影響的分組

注：Control表示空白組為NR8383細(xì)胞；LPS為炎性刺激組

2 結(jié)果

2.1 IL-1β mRNA的相對(duì)qPCR擴(kuò)增效率曲線(xiàn) 見(jiàn)圖1。

圖1 NR8383細(xì)胞IL-1β mRNA相對(duì)定量的熔解曲線(xiàn)和擴(kuò)增效率曲線(xiàn)

注：左圖為IL-1β mRNA RT-qPCR的熔解曲線(xiàn)； 右圖為IL-1β mRNA RT-qPCR的擴(kuò)增效率曲線(xiàn)， R2=99.6%，E=121.3%

圖1中左圖IL-1 β mRNA熔解曲線(xiàn)呈單一峰，表明產(chǎn)物單一,試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠；右圖10倍濃度梯度稀釋樣品中的mRNA含量與擴(kuò)增效率曲線(xiàn)中Ct值相關(guān)，擴(kuò)增效率較好。圖1結(jié)果綜合表明RT-qPCR法可檢測(cè)IL-1 βmRNA。

2.2 不同濃度TCA對(duì)經(jīng)LPS作用后NR8383細(xì)胞的IL-1 β mRNA的影響 見(jiàn)圖2。

圖2表明與Control組比較，LPS可極顯著增加NR8383細(xì)胞IL-1β mRNA含量(P<0.01)；與LPS組相比較，TCA1可降低LPS誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞IL-1β mRNA含量；TCA2、TCA3可極顯著降低LPS誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞IL-1β mRNA含量(P<0.01)。

圖2 不同濃度TCA對(duì)經(jīng)LPS作用后NR8383細(xì)胞的IL-1β mRNA的影響

注：圖2為經(jīng)LPS作用后TCA對(duì)NR8383細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)量的相對(duì)值；TCA1表示1 000 μmol/L的TCA,TCA2表示 500 μmol/L 的TCA,TCA3表示100 μmol/L的TCA,Control表示空白組，：與Control組比較差異顯著P<0.05，：與Control組比較差異極顯著P<0.01；：與LPS組比較差異顯著P<0.05，：與LPS組比較差異極顯著P<0.01

2.3 不同濃度TCA對(duì)經(jīng)LPS作用后NR8383細(xì)胞的IL-1β蛋白含量的影響 見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度TCA對(duì)經(jīng)LPS作用后NR8383細(xì)胞的IL-1β蛋白含量的影響

注：圖3為經(jīng)LPS作用后TCA對(duì)NR8383細(xì)胞IL-1β蛋白含量的影響；TCA1表示1 000 μmol/L的TCA,TCA2表示500 μmol/L的TCA,TCA3表示100 μmol/L的TCA,Control表示空白組，：與Control組比較差異顯著P<0.05，：與Control組比較差異極顯著P<0.01；：與LPS組比較差異顯著P<0.05，：與LPS組比較差異極顯著P<0.01

圖3表明，與Control組相比，LPS可極顯著增加NR8383細(xì)胞中的IL-1β蛋白含量(P<0.01)。與LPS組相比較，TCA1顯著降低LPS誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞蛋白含量(P<0.05)；TCA2、TCA3可極顯著降低LPS誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞蛋白含量(P<0.01)。

3 討論

巨噬細(xì)胞具有分泌細(xì)胞因子(IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α)和吞噬、殺傷多種病原微生物的作用[4]，是單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的主要成員。提高巨噬細(xì)胞吞噬能力可促進(jìn)免疫因子的分泌，增強(qiáng)免疫功能[5]。在免疫調(diào)節(jié)方面，TCA能恢復(fù)被LPS刺激和環(huán)孢菌素A抑制的TNF-和IL-1β水平，提高CD4+/CD8+淋巴細(xì)胞百分率并影響IgG分泌量[6]。上述發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究TCA的免疫調(diào)節(jié)作用提供了依據(jù)。脂多糖(LPS)是從革蘭陰性菌外膜分離的一種強(qiáng)效炎性刺激劑，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌大量ILs，導(dǎo)致宿主快速產(chǎn)生反應(yīng)[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)LPS可以刺激細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)磷酸化，且LPS使肺組織磷酸化ERK1/2表達(dá)顯著升高[8]。膽汁誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染TGR5的THP-1細(xì)胞表達(dá)CAMP，抑制LPS誘導(dǎo)TNF-的產(chǎn)生[9]，TCA可能通過(guò)PKC-ERK信號(hào)通路影響NR8383細(xì)胞中LPS介導(dǎo)的ERK的活化，參與肺的巨噬細(xì)胞的調(diào)控[10]。由此可見(jiàn)作為膽汁酸的特異性受體蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5(TGR5)參與膽汁酸對(duì)IL-1β調(diào)節(jié)作用，提示TCA可能通過(guò)影響ERK1/2磷酸化對(duì)LPS刺激細(xì)胞所致的炎性作用。鑒于巨噬細(xì)胞的特性，結(jié)合大鼠肺臟中含較高的TGR5受體，本研究選用了大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)LPS誘導(dǎo)后IL-1 β mRNA和蛋白的含量結(jié)果證實(shí)了上述結(jié)論，即TCA參與了大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的抗炎免疫調(diào)節(jié)作用。為牛、羊膽汁中TCA的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)，為臨床開(kāi)發(fā)和應(yīng)用TCA治療肺部相關(guān)疾病奠定了分子研究基礎(chǔ)和藥理理論依據(jù)。綜上所述，本研究可得出如下結(jié)論：1 000 μmol/LTCA降低LPS誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞分泌IL-1 β mRNA和蛋白含量(P<0.05)；500 μmol/L、100 μmol/L的TCA可極顯著降低LPS誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞分泌IL-1β mRNA和蛋白含量(P<0.01)。TCA對(duì)LPS誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞的免疫反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用。

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Effects of TCA on the regulation ofIL-1β induced by PD98059 in NR8383 cells

WANG Cai-yun1,2,, ZHANG Zhao-yi1,2, ZHANG Zi-ying1,2,3, GUAN Hong1,2, LI Pei-feng1,2

(1.College of Veterinary Medicine,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China ; 2.Key Laboratory of Clinical Diagnosis and Treatment Techniques for Animal Disease,Ministry of Agriculture,Hohhot 010018，China;3.College of Basic Medicine,Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010110,China)

In this study we investigated the comprehensive pharmacological effects of taurocholic acids (TCA,a kind of natural bioactive substance of animal bile acids) on the production of IL-1β in NR8383 cells.The results showed that TCA had a suppressive effect on LPS induced NR8383 cells by analyzing IL-1 mRNA and protein levels using the qPCR and ELISA.The level of IL-1β mRNA and protein induced by LPS was significant (P<0.01).TCA at a concentration of 1000,500 or 100 μM significantly decreased LPS-induced production of IL-1β in NR8383 cells(P<0.01).Our findings suggest that TCA has an anti-inflammatory immune regulating effect.

TCA; NR8383 cells; IL-1β; Anti-inflammatory immune

2016-07-27

內(nèi)蒙古自治區(qū)高校自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(NJZZ049);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160487)

王彩云(1969-)，女(蒙古族)，副教授，博士,從事動(dòng)物解剖學(xué)工作,E-mail：wangcaiyun688@163.com

S859.7

A

0529-6005(2016)12-0021-03