李勇慧, 于相麗, 程彥偉, 吳 浩

(洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 河南洛陽471022)

豫西地區(qū)H9亞型禽流感病毒分離鑒定及HA基因的序列分析

李勇慧, 于相麗, 程彥偉, 吳 浩

(洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 河南洛陽471022)

為了了解禽流感的生物學(xué)特性和遺傳進化規(guī)律，有效防治禽流感疫情，本試驗從河南省洛陽地區(qū)發(fā)現(xiàn)疑似H9亞型禽流感的病死雞中分離得到兩株病毒(LYPLK1和LYPLK2)，經(jīng)鑒定為H9亞型禽流感病毒，通過RT-PCR方法擴增其HA基因進行序列分析。結(jié)果分離株屬于H9亞型禽流感歐亞系Y280/97分支，并發(fā)生了一定的變異。

H9亞型禽流感 ； HA基因 ； 序列分析

禽流感(AI)，是由禽流感病毒引起的禽類的一種傳染病。它可以感染多宿主，包括人、豬、馬、水貂和禽類等，主要侵害家禽呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的傳染病。根據(jù)表面糖蛋白凝血素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同，病毒可分為16個HA亞型和9個NA亞型。1998年中國首先發(fā)現(xiàn)H9N2亞型禽流感病毒可以感染人[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在我國華東地區(qū)出現(xiàn)感染人的H7N9亞型流感病毒，其6個內(nèi)部基因片段均來自于H9N2亞型禽流感病毒[2]。血凝素(HA)是禽流感病毒中最重要的保護性抗原，其裂解位點的序列直接影響毒株致病力的高低。在病毒增殖過程中，HA基因組很容易發(fā)生基因重排，存在廣泛的抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變現(xiàn)象，是遺傳性和抗原性的突變頻率最高的基因[8]。因此篩選HA基因片段進行遺傳分析能代表H9亞型禽流感基因組的重要特征。

本試驗通過對河南省洛陽地區(qū)疑似H9亞型禽流感的病死雞進行病料采集與處理，對毒株進行分離與鑒定，使用RT-PCR方法擴增其HA基因，測定出HA基因序列。通過閱讀文獻[3-5]，與從NCBI網(wǎng)站上下載其他參考毒株的HA基因序列進行同源性比較和系統(tǒng)進化樹分析。從分子水平上了解H9亞型禽流感病毒的變異情況，為制定防治該亞型禽流感流行提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料 洛陽普萊柯生物工程股份有限公司診斷室于2015年接收來自洛陽不同雞場送檢的疑似H9亞型禽流感的病死雞各1只，分離鑒定并保存，A/Chicken/Henan/LY/2015株(簡稱LYPLK1)和A/Chicken/Henan/LY/2015株(簡稱LYPLK2)。

1.2 試劑 標(biāo)準陽性血清，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所和中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；病毒核酸提取試劑盒，購自臺灣旭基公司；rTaqDNA聚合酶、2.5 mmol/L dNTP Mix、6×Loading Buffer、瓊脂糖；溴化乙錠；滅菌雙蒸水；PBS；1×TAE電泳緩沖液。

1.3 儀器 培養(yǎng)箱、微量振蕩器、孵化機、生物安全柜、超凈工作臺、分析天平、離心機、PCR擴增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀、液氮罐或-70 ℃冰箱、微波爐、高通量研磨器、-20 ℃冰箱、水浴鍋等。

1.4 引物 引物由普萊柯生物工程股份有限公司診斷室提供。反轉(zhuǎn)錄引物：隨機引物6N。PCR引物：引物HA-F和HA-M-R擴出的片段是1 089 bp，HA-M-F和HA-R擴出的片段是970 bp，一起測序后將所得片段進行拼接，即H9-HA基因全長。

1.5 方法

1.5.1 病料采集處理 首先對病死雞進行剖檢，觀察病變，無菌采集病變嚴重部位，樣品處理或-20 ℃冰箱保存。

將采集的病料各部位無菌取下一小塊用PBS沖洗干凈，充分剪碎，反復(fù)研磨制成勻漿，加適量PBS制成組織懸液；反復(fù)凍融3次后，以4 000 r/min離心10 min；取少量上清液，分裝入兩個滅菌離心管中，8 000 r/min離心5 min；將上清液轉(zhuǎn)移至另一滅菌離心管中。

1.5.2 病毒分離收取尿囊液 選用10日齡發(fā)育良好的SPF雞胚各3枚，標(biāo)出尿囊注射部位；在標(biāo)記處消毒并打孔；注射0.2 mL；封閉注射孔，氣室朝上于37 ℃孵化機中孵育。每天照檢2次，棄去24 h內(nèi)的死胚。

72 h后，將活胚置于-20 ℃冰箱30 min；取出后，消毒蛋殼，沿氣室上方剪出一個大孔；吸取尿囊液，準備待測抗原。

1.5.3 血凝試驗 取96孔V型反應(yīng)板，用多通量移液器向反應(yīng)板的每孔加PBS 25 μL；取待測抗原25 μL于第1孔，并吹打8～10次，后吸出25 μL至第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，棄去25 μL，第12孔為陰性對照；取1%紅細胞懸液加入各孔，每孔25 μL；振蕩混勻后靜置30 min后觀察并記錄結(jié)果。1.5.4 配置4單位抗原 由血凝試驗得到抗原的效價，根據(jù)抗原效價配置相應(yīng)比例的抗原稀釋度，配成4單位抗原。

1.5.5 血凝抑制試驗 取96孔V型反應(yīng)板，用微量移液器加25μL PBS于各孔中；吸取標(biāo)準陽性血清25 μL置于第1孔，倍比稀釋至第11孔，棄去25 μL，第12孔對照；吸取4單位抗原25 μL于各孔，振蕩混勻后室溫靜置20 min；吸取1%雞紅細胞懸液25 μL于各孔，振蕩混勻后室溫靜置30 min后觀察并記錄結(jié)果。

1.5.6 PCR體系配制 體系配置由普萊柯生物工程股份有限公司診斷室提供，其中先25 μL體系擴增目的基因，得到特異性條帶后，再50 μL體系擴增。

1.5.7 核酸提取 用臺灣旭基公司病毒核酸提取試劑盒(Viral Nucleic Extraction KitⅡ)提取混合樣中核酸。

1.5.8 PCR擴增 置于PCR儀中進行PCR擴增。

1.5.9 凝膠配制與電泳 配置濃度為2%瓊脂糖凝膠，將凝膠塊浸沒于電泳槽的TAE溶液中，分別將DNA Marker 2 000 bp、陽性對照、陰性對照、空白對照和PCR擴增的產(chǎn)物取出2～5 μL點入凝膠孔中，電泳的時間為30 min。通過紫外凝膠成像儀觀察特異性條帶并照相記錄。

1.5.10 測序與序列分析 將擴增的產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序；拿到測序結(jié)果后，利用DNAStar軟件中的SeqMan進行基因序列的拼接，并在NCBI網(wǎng)站上下載參考株和H9亞型禽流感疫苗株(見表1)的HA基因序列；應(yīng)用MegAlign進行HA基因的序列分析，使用Clustal W(多重序列比對)方法進行核苷酸同源性比較和繪制系統(tǒng)進化樹。

表1 H 9亞型禽流感病毒的參考株和疫苗株

2 結(jié)果

2.1 病毒分離與鑒定 對待測抗原進行血凝抑制試驗鑒定檢測該抗原對標(biāo)準陽性血清無凝集作用，結(jié)果LYPLK1和LYPLK2對H9標(biāo)準陽性血清的血凝價均為1∶1 024(混合樣)。所以鑒定該毒株為H9亞型禽流感。

2.2 RT-PCR及測序結(jié)果 如圖1和圖2兩張電泳圖可看出，目的基因的擴增產(chǎn)物的特異性很高，無其他雜帶，可將含目的基因那部分的凝膠塊切下送往測序。測序后，經(jīng)SeqMan軟件拼接基因序列，得到LYPLK1的基因長度為1 769 bp，LYPLK2的基因長度為1 741 bp。

圖1 H9-970 PCR電泳圖

圖2 H9-1089 PCR電泳圖

注：兩圖中M：DNA Marke rDL-2000;1:陽性對照(圖1 970 bp，圖2 1 089 bp);2:陰性對照;3:空白對照;4:LYPLK1;5:LYPLK2

2.3 HA基因核苷酸序列分析結(jié)果 利用MegAlign軟件，將兩株分離株的HA基因與參考株及疫苗株進行遺傳進化分析，并繪制系統(tǒng)進化樹。根據(jù)H9亞型基因序列的特點[6-8]，將其分為歐亞系和北美系兩大分支。歐亞系又可分為3個亞系：以Y280/97和BJ/94為代表株的Ⅰ群，以G1/97為代表株的Ⅱ群，以Y439/97為代表株的Ⅲ群；北美系以W1/66為代表。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，分離株LYPLK1和LYPLK2之間的核苷酸同源性為98%。LYPLK1與參考株G19/11的核苷酸同源性最高，為95.6%；與其他代表株的核苷酸同源性比較中，最高為Y280/97的91.2%，最低為W1/66的80.7%。而LYPLK2同LYPLK1的比對結(jié)果差不多，與參考株G19/11的核苷酸同源性最高，為95.9%；與其他代表株的核苷酸同源性比較中，最高為Y280/97的91.7%，最低為W1/66的80.5%。如圖3，分離株LYPLK1和LYPLK2與G19/11的親緣關(guān)系最近，與G1/97的親緣關(guān)系較遠，所以LYPLK1和LYPLK2屬于歐亞系Ⅰ群的Y280/97小分支。

所選疫苗株均為國內(nèi)疫苗生產(chǎn)廠家使用的經(jīng)典疫苗株。如圖3，其中HL/01屬于歐亞系Ⅰ群的Y280/97小分支；F/98、SD6/96、GDSS/94、G9/97均屬于歐亞系Ⅰ群的BJ/94小分支；HK1073/99、HK33982/09均屬于歐亞系Ⅱ群。分析發(fā)現(xiàn)，LYPLK1與親緣關(guān)系最近的HL/01的同源性為91.6%，與其他疫苗株的同源性為84.8%～91%；LYPLK2與親緣關(guān)系最近的HL/01的同源性為92.1%，與其他疫苗株的同源性為84.6%～91.4%。

3 討論

3.1 本試驗通過對病毒的分離與鑒定，確定分離株LYPLK1和LYPLK2均為H9亞型禽流感病毒。

3.2 通過系統(tǒng)進化樹判斷出LYPLK1和LYPLK2均屬于H9亞型禽流感病毒歐亞系的Y280/97分支。目前我國大部分分離株均屬于此類，并且屬于地方性流行。本試驗分離的兩株H9亞型禽流感病毒的核苷酸同源性為98%，且在系統(tǒng)進化樹上處于同一小分支，符合我國大陸H9亞型禽流感病毒HA的進化特點。兩個分離株與Y280/97的同源性分別為91.2%、91.7%，表明HA基因在遺傳進化方面發(fā)生了一定的變異。

3.3 兩個分離株與親緣關(guān)系最近的疫苗株HL/01的同源性分別僅為91.6%、92.1%，說明分離株已經(jīng)向遠離傳統(tǒng)疫苗株的方向進化，產(chǎn)生了一定的遺傳距離，將會導(dǎo)致現(xiàn)有疫苗免疫效果不佳，不能對免疫雞群提供完全保護。禽流感病毒HA基因的頻繁變異給禽業(yè)發(fā)展和疫苗研究帶來非常大的困難，利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)，研發(fā)新型疫苗已成為研究的熱點[9]。

4 小結(jié)

對于禽流感病毒的防治，需要建立快速檢測方法，做到源頭撲殺、切斷傳播途徑；加快新型疫苗的研發(fā)，從分子水平上了解H9亞型禽流感病毒的變異情況，為制定防治該亞型禽流感流行的有效對策提供理論依據(jù)。本試驗對河南省洛陽地區(qū)得到的H9亞型禽流感病毒分離株，進行測序及序列分析，而關(guān)于疫苗研發(fā)工作需要進一步的研究。

圖3 分離株與參考株及疫苗株HA基因的系統(tǒng)進化樹

[1] 郭元吉,李建國,程小雯,等.H9N2亞型流感病毒能感染人的發(fā)現(xiàn)[J].中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志,1999,13(2): 105-108.

[2] Gao R B,Cao B,Hu Y W,etal.Human infection with a novel avian-origin Influenza A(H7N9) vinus[J].New Englang Journal Medicine,2013,368(20): 1888-1897.

[3] 張偉,徐懷英,孟芳,等.1999-2013年山東H9N2亞型禽流感病毒HA基因的演化和HI抗原性差異分析[J].中國科學(xué):生命科學(xué),2015,02:190-199．

[4] 胡媛媛,張文東,宋建領(lǐng),等.2013年云南省禽流感H9N2亞型病毒神經(jīng)氨酸酶基因序列分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2015，06：765-770．

[5] 葛菲菲,劉健,楊德全,等.上海市三株H9N2鴨禽流感病毒全基因遺傳進化分析[J].中國動物傳染病學(xué)報,2014,22(2):15-20．

[6] 劉國乾,曹藍,和君,等.三株H9N2亞型禽流感病毒全基因組序列分析[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2012,33(5):1-7．

[7] 李廣偉,嚴專強,廖昌韜,等.兩廣地區(qū)2011-2012年H9N2亞型禽流感病毒的HA基因進化分析[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2014,34(3)：461-464．

[8] 劉彥云,劉春國,王壽山,等.10株H9N2亞型禽流感病毒血凝素基因的序列分析[J],中國畜牧獸醫(yī),2013,40(8):13-19．

[9] 張毅,王幼明,王芳,等.我國禽流感研究進展及成就[J].微生物學(xué)通報,2014,03:497.

The isolation of H9 subtype AIV and sequence analysis of HA gene

LI Yong-hui,YU Xiang-li,CHENG Yan-wei，WU Hao

(Life Science College,Luoyang Normal University,Luoyang 471022,China)

Samples of suspected H9 subtype avian inflenza illness chickens were collected from Luoyang in Henan province,and two virus strains(LYPLK1 and LYPLK2)were isolated.The HA gene of them were amplified by RT-PCR method and sequenced.Sequence analysis showed that the two isolated belonged to H9 subtype of avian influenza Eurasian Y280/97 branches,and a certain variation．

H9 subtype of AIV ； HA gene ； sequence analysis

2015-12-10

NSFC-河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金(U1204307)；藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點實驗室開放課題資助(MR &NPC2015002)；河南省高等學(xué)校重點科研項目(15A2100410)

李勇慧(1977-)，女，副教授，碩士，主要從事植物學(xué)生物技術(shù)方面研究，E-mail:huiyongli8209@126.com

S852.65

A

0529-6005(2016)12-0017-04