李昌靜 , 王冬冬 , 王建琳， 王守春， 郭妍妍 , 尹燕博,3

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院， 山東青島266109； 2.青島澳蘭百特生物工程有限公司，山東青島266101； 3.中國鴕鳥養(yǎng)殖開發(fā)協(xié)會鴕鳥疫病防制中心， 山東青島266109)

鴕鳥Ⅰ群禽腺病毒的分離鑒定、血清型鑒定以及Hexon蛋白基因序列分析

李昌靜1, 王冬冬1, 王建琳1， 王守春2， 郭妍妍2, 尹燕博1,3

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院， 山東青島266109； 2.青島澳蘭百特生物工程有限公司，山東青島266101； 3.中國鴕鳥養(yǎng)殖開發(fā)協(xié)會鴕鳥疫病防制中心， 山東青島266109)

對3份來自不同地方的病死鴕鳥進(jìn)行病理剖檢、病原分離鑒定，確診為Ⅰ群禽腺病毒感染，并成功分離到3株鴕鳥FAV-Ⅰ。采用PCR方法成功擴(kuò)增2株臨床分離株的Hexon基因，分別克隆于pMD20-T載體，對其進(jìn)行了核苷酸序列測定、同源性比較及遺傳進(jìn)化分析。并運用Ⅰ群禽腺病毒12個標(biāo)準(zhǔn)毒陽性血清對其中2株毒進(jìn)行了血清型鑒定。結(jié)果顯示，分離株2014.07.10-HBHD-TN、2014.07.19-HBHS-TN與12個標(biāo)準(zhǔn)株之間的同源性在72.5%～98.0%之間，其中與FAV-4的同源性最高是98.0%。在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，這兩個分離株均位于FAV-I的大分支中，且與FAV-4位于同一小分支。這2個分離株經(jīng)血清學(xué)鑒定均為血清4型的毒株。

鴕鳥； FAV-Ⅰ； 分離鑒定； 序列分析； 血清學(xué)鑒定

禽腺病毒(Fowladenovirus, FAV)屬于禽腺病毒科禽腺病毒屬，根據(jù)其抗原性的不同可分為3個群，Ⅰ群禽腺病毒包括從雞、火雞、鵝和其他禽類分離的共12個血清型，它們都含有相同的群抗原。從雞體內(nèi)分離到Ⅰ群禽腺病毒的情況已有很多報道，但從鴕鳥體內(nèi)分離到Ⅰ群禽腺病毒的報道不多。在鴕鳥養(yǎng)殖場，鴕鳥的發(fā)病、死亡以及不良的孵化率都與腺病毒有關(guān)[1]。本實驗室分別在2014年7月10日、7月19日以及9月4日接診了來自河北不同地方的3批疑似Ⅰ群禽腺病毒感染的鴕鳥病例，并對其進(jìn)行病理剖檢，病毒的分離鑒定，血清型鑒定以及基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1 材料

毒株、試劑及血清 病料樣品來自我國河北省幾個鴕鳥養(yǎng)殖場；SPF種胚，購自山東省無特定病原雞實驗種雞場，由本實驗室孵化；克?、袢呵菹俨《綡exon蛋白全基因所用菌株為感受態(tài)細(xì)胞DH5α和pMD20-T載體，購自寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；Ⅰ群禽腺病毒12個血清型標(biāo)準(zhǔn)毒的陽性血清(由本實驗室制備并保存)。

2 方法

2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中Ⅰ群禽腺病毒CELO株(AAU46933)的Hexon基因序列，應(yīng)用Premier 5.0設(shè)計了Ⅰ群禽腺病毒的檢測引物和Hexon全基因的測序引物[由生工生物工程(上海)股份有限公司合成]如下[2-3]：

表1 本研究中應(yīng)用的引物

2.2 樣品處理 對來自我國河北省幾個鴕鳥養(yǎng)殖場的疑似Ⅰ群禽腺病毒感染的鴕鳥進(jìn)行剖檢、病理變化觀察，并取肝組織和腎組織按1:5的比例加入生理鹽水進(jìn)行研磨，研磨后放-20℃冰箱反復(fù)凍融后備用。

2.3 病毒的雞胚分離 將處理后樣品經(jīng)5 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，通過卵黃囊途徑接種10日齡SPF雞胚，0.2 ml/L胚，同時設(shè)陰性對照。置37 ℃溫箱孵育24 h剔除死胚，收獲48 h以后死亡胚及19日齡活胚，并記錄雞胚死亡時間，觀察雞胚各組織器官的病變。按上述方法連傳3代后，收取胚肝和胚腎組織進(jìn)行PCR鑒定。

2.4 雞胚分離物的PCR鑒定 胚肝和胚腎組織經(jīng)處理后，離心取上清液，按常規(guī)方法提取核酸[3]，再按以下PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增：采用30 μL的PCR反應(yīng)體系：DNA 模板2 μL，10×PCR Buffer(Mg2+free)3 μL,MgCl2(25 mmol/L)4 μL, dNTP(2.5 mmol/L)2.5 μL，Taq酶(5 U/μL)0.5 μL，檢測引物FAV-1、FAV-2各0.5 μL(25 nmol/L),加滅菌超純水17 μL，經(jīng)94 ℃ 5 min預(yù)變性，然后94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 90 s，30個循環(huán)擴(kuò)增，72 ℃終延伸10 min。4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物8 μL，以DL-2 000為Marker，1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴(kuò)增片段大小。

2.5 2個分離株的血清型鑒定 將經(jīng)雞胚傳3代且PCR檢測為陽性的雞胚分離物作為病毒抗原，用未接毒的SPF雞胚胚肝和胚腎的混合樣作為陰性對照抗原，用Ⅰ群禽腺病毒12個血清型標(biāo)準(zhǔn)毒的陽性血清作為抗體，運用雙向免疫瓊脂擴(kuò)散試驗對病毒進(jìn)行血清學(xué)分型。

2.6 2個分離株Hexon蛋白基因序列測定及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 按常規(guī)方法提取核酸，并用測序引物A1A2、B1B2、C1C2對目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。再將擴(kuò)增的目的基因與pMD19-T載體進(jìn)行連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，涂平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選,將白色菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，置37 ℃劇烈震蕩培養(yǎng)12～16 h后，進(jìn)行PCR鑒定后[4]，將陽性菌液送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果經(jīng)DNAStar軟件剪切拼接，得到完整的目的基因序列。

應(yīng)用MEGA 4.1軟件，通過Clustal W方法，以Hexon基因編碼區(qū)核苷酸序列為基礎(chǔ)，對本研究2個分離株Hexon全基因與Ⅰ群禽腺病毒12個標(biāo)準(zhǔn)血清型代表株Hexon全基因(本實驗室測定-序列待提交)以及GenBank已注冊的禽腺病毒FAV-Ⅰ的代表株AAU46933(CELO株)，參考株AY849321、AF074946 (同屬FAV-Ⅱ)，Y09598 (屬FAV-Ⅲ)Hexon全基因進(jìn)行核苷酸同源性鄰近排組分析，構(gòu)建Hexon全基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

3 結(jié)果

3.1 臨床病理學(xué)觀察 發(fā)病鴕鳥不能站立，以肘關(guān)節(jié)著地，食欲減退，逐漸消瘦，肘關(guān)節(jié)腫大。剖檢可見，肝臟腫大，邊緣鈍圓，色淺呈土黃色，有條索狀出血；心臟畸形，心內(nèi)膜有出血點；肺臟出血、淤血，有的可見豌豆大小增生物，呈乳白色；氣管出血；腎臟胰腺出血。

3.2 雞胚的病變觀察 接種雞胚后第5天出現(xiàn)死胚，第7天到第8天為死亡高峰，收集死胚及19日齡的未死胚。剖檢，觀察發(fā)現(xiàn)絨毛尿囊膜有不同程度增厚，呈云霧狀。胚體發(fā)育不良，瘦小，羽毛稀少，有的體表潮紅。肝臟腫大、出血，質(zhì)脆呈灰黃色，有的表面及邊緣可見灰白色壞死點，邊緣有時呈灰白色彌漫性壞死。腎臟有不同程度腫大、出血。對照組正常無病變。

3.3 雞胚分離物的PCR鑒定 腺病毒的特異性引物對雞胚分離物和陰性對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可以在508 bp處看見明顯的擴(kuò)增條帶，而陰性樣品未擴(kuò)增出條帶(如圖1所示)。結(jié)果說明，本次試驗成功分離到3株Ⅰ群禽腺病毒的雞胚分離物。

圖1 雞胚分離物PCR檢測結(jié)果

3.4 2個分離株的血清型鑒定結(jié)果 利用Ⅰ群禽腺病毒12個血清型標(biāo)準(zhǔn)毒的陽性血清，運用雙向免疫瓊脂擴(kuò)散試驗對病毒進(jìn)行血清學(xué)分型結(jié)果顯示，在2株分離株與血清4型的陽性血清之間均可見一條清晰的白色沉淀線，但與其他幾個陽性血清之間沒有沉淀線出現(xiàn)，說明本實驗室從鴕鳥體內(nèi)分離到的2株Ⅰ群禽腺病毒是屬于血清4型。

3.5 2個臨床分離株Hexon全基因遺傳進(jìn)化分析 同源性分析發(fā)現(xiàn)，2個分離株、12個標(biāo)準(zhǔn)株與FAV-Ⅰ的代表株AAU46933(CELO株)之間的同源性在74.8%～99.9%,與參考株AY849321、AF074946 (同屬FAV-Ⅱ)，Y09598 (屬FAV-Ⅲ)的同源性分別是48.9%～52.5%、51.2%～57.5%。除此之外，分離株2014.07.10-HBHD-TN、2014.07.19-HBHS-TN之間的同源性為100%，且與12個標(biāo)準(zhǔn)株之間的同源性在72.5%～98.0%之間，其中與FAV-4的同源性最高是98.0%(如圖2所示)。

圖2 2個臨床分離株與禽腺病毒Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群代表株基因序列之間的同源性比較

如中插彩版圖3所示，12個血清型代表株和2個臨床分離株與Ⅰ群禽腺病毒(FAV-Ⅰ)代表株AAU46933(CELO株)位于同一個大的分支，親緣關(guān)系較近，表明12個血清型代表株和2個臨床分離株同屬于Ⅰ群禽腺病毒。并且這2個分離株均位于FAV-4所在的分支。參考株AY849321、AF074946 (同屬FAV-Ⅱ)，Y09598 (屬FAV-Ⅲ)位于另外兩個分支，與 FAV-Ⅰ群親緣關(guān)系則較遠(yuǎn)。

4 討論

Ⅰ群禽腺病毒可以通過接種雞胚和細(xì)胞進(jìn)行分離鑒定，常用的雞胚接種途徑有3種：卵黃囊接種，絨毛尿囊膜接種，尿囊腔接種。絨膜尿囊膜途徑接種較尿囊腔接種更易分離到病毒[5]，但有報道已指出11個血清型的毒株經(jīng)卵黃囊接種，可以在胚體中繁殖，而絨毛尿囊膜接種稍差[6]。血清學(xué)方法是I群禽腺病毒分型的常規(guī)方法[7-8]。分子生物學(xué)方法，如PCR、測序等，是通過比較分析基因序列對毒株進(jìn)行基因分型。所以，本試驗采用了卵黃囊接種途徑，通過接種SPF雞胚成功從鴕鳥樣品中分離到3株Ⅰ群禽腺病毒。并運用血清學(xué)方法成功鑒定了其中2個分離株2014.07.10-HBHD-TN、2014.07.19-HBHS-TN的血清型，且這2個分離株均為血清4型。對這2個分離株進(jìn)行同源性以及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，兩分離株之間的同源性為100%，且都與FAV-4的同源性高達(dá)98.0%。除此之外，這兩個分離株在系統(tǒng)進(jìn)化樹上與FAV-4是位于同一分支。

以上數(shù)據(jù)表明，本次試驗分離到的2個毒株是同一毒株在不同地方的感染，且該毒株可能是由于當(dāng)?shù)氐募仪菟鶖y帶的毒感染了野鳥，由野鳥帶到鴕鳥養(yǎng)殖場感染了鴕鳥，這只是一種推測，具體的情況還需要進(jìn)一步考證。

從鴕鳥中分離到血清4型的Ⅰ群禽腺病毒，在我國還沒有報道。雖然在國外有從鴕鳥體內(nèi)分離到Ⅰ群禽腺病毒的先例，但在我國并沒有得到足夠多的重視。本試驗表明，Ⅰ群禽腺病毒已經(jīng)開始對我國鴕鳥養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生影響了，這提示我們廣大鴕鳥養(yǎng)殖戶應(yīng)該從現(xiàn)在開始做好Ⅰ群禽腺病毒的預(yù)防。

[1] Li P, Bellett A J,Parish C R.The stuctural proteins of chick embryo lethal orphan virus (fowl adenovirus type 1) [J].J Gen Virol, 1984, 65:1803-1815.

[2] Chiacco S,Kurzbauer R., Sehaffner G.The complete DNA sequence and genomic organization of Avian Adenoviras CELO[J]. J Virol, 1996, 70(2):2939-2949.

[3] 唐熠,謝芝勛,熊文婕,等.PCR-RFLP技術(shù)對Ⅰ群禽腺病毒12個血清型毒株的分型鑒定[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué), 2009，39(10):886-889.

[4] Regenmortel M H V Van,Fauquet C M,Bishop D H,etal.Virus Taxonomy.Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses Academic[J].Virus Research, 2002, 83(1):227-238.

[5] Kawamura H，Shimizu F，Tsubahara H.avian adenovirus:its properties and serological classfication [J].Natl Inst Anim Health Q (Tokyo)，1964,4:183-193.

[6] Van Regenmortel M H V，F(xiàn)auquet C M，Bishop D H L,etal.Virus Taxonomy.Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses Academic[J].Virus Research，2002，83(1):221-222.

[7] McFerran J B，Clarke J K，Connor T J.Serological classification of avian adenoviruses[J].Arch Gesamte Virusforsch，1972,39(1):132-139.

[8] McFerran J B，Connor T J.Further studies on the classification of fowl adenoviruses[J].Avian Dis，1977,21(4):585-595.

Gene sequence analysis of hexon protein and separation identification and serotype identification of fowl adenovirus group Ⅰin ostrich

LI Chang-jing1， WANG Dong-dong1， WANG Jian-lin1， WANG Shou-chun2， GUO Yan-yan2， YIN Yan-bo1,3

(1.College of Animal Science and Technology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 2.Qingdao Oland-Better Biological Engineering company, Qingdao 266001, China; 3.China association of ostrich farming development and epidemic prevention center, Qingdao 266109, China)

Three cases of ostriches came from different parts were diagnosed with fowl adenovirus of groupⅠ infections and 3 strains of FAV-Ⅰ were successfully isolated in ostriches. The nucleotide sequences of DNA of hexon gene of 2 isolates were amplified by PCR, and cloned into pMD20-T carrier, The cloned genes were then sequenced and analyzed. Serotypes of 2 isolates were identified by comparing with 12 serotype standard strains of fowl adenovirus group Ⅰ. The results showed that the homology between isolates of 2014.07.10 HBHD-TN, 2014.07.19 HBHS-TN and 12 standard strains is 72.5%-98.0%. Of them , it has the highest homology with FAV-4, which is up to 98.0%. In system evolutionary tree, both the two isolates were located in the same big branch of FAV-Ⅰ, and in the same small branches with FAV-4. The two isolates were identified as strains of serotype 4 by serological identification.

Ostrich; FAV-Ⅰ;isolation and identification; sequence analysis; serological identification

YIN Yan-bo

2015-11-16

畜禽重大疫病防控與高效安全養(yǎng)殖綜合技術(shù)研發(fā)重點專項(2016YFD0500806);山東省自然科學(xué)基金(ZR2010CM 014)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(SDAIT-13-011-03)

李昌靜(1987-)，女，碩士，研究方向為獸醫(yī)病理學(xué)及相關(guān)分子生物學(xué)，E-mail:lichangjing2007_@126.com

尹燕博，E-mail:yanboyin2011@163.com

S852.65

A

0529-6005(2016)12-0014-03