高俊峰 ， 柳亞楠 ， 王永強 ， 曹 紅 ， 李曉齊 ， 鄭世軍

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室 ， 北京海淀100193)

雞白介素10(chIL-10)單克隆抗體的制備及鑒定

高俊峰 ， 柳亞楠 ， 王永強 ， 曹 紅 ， 李曉齊 ， 鄭世軍

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室 ， 北京海淀100193)

為制備雞白介素10(chIL-10)單克隆抗體，以常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)從禽細(xì)胞系MDCC-MSB1 克隆chIL-10 基因，將去信號肽chIL-10基因亞克隆至原核表達(dá)載體pET-30a，并在大腸桿菌中表達(dá)，純化后作為免疫原免疫BALB/c 小鼠。經(jīng)4次免疫后，取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)融合。將原核表達(dá)的GST-chIL-10融合蛋白作為包被抗原，利用間接ELISA 篩選陽性克隆。陽性細(xì)胞株經(jīng)3次亞克隆后，獲得3株穩(wěn)定分泌chIL-10 抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆，分別命名為4B2、4F3 以及1E3。經(jīng)間接ELISA 測定，以上3 株雜交瘤細(xì)胞腹水效價為1∶3.2×106，親和力解離常數(shù)(Kd)分別為1.05×10-9、5.01×10-10以及7.59×10-10?？贵w重鏈類型分別為IgG2a、IgG2a以及IgG1。經(jīng)Western Blot 試驗證明，3株單抗均能特異地識別原核或真核表達(dá)的chIL-10蛋白，4B2、4F3單抗識別的抗原表位區(qū)域為chIL-10 N端的1 aa～52 aa，1E3識別的是N端的52 aa～102 aa。這些單抗為雞IL-10的檢測及生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。

雞IL-10 ； 原核表達(dá) ； 單克隆抗體

Fiorentino 等首先描述了IL-10 是由Th2 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子[1]。LisaRothwell 等從感染艾美耳球蟲的雞盲腸扁桃體提取總RNA，經(jīng)RT-PCR 獲得chIL-10 的全長cDNA 序列，其編碼一條175 個氨基酸的多肽，其中有21 個氨基酸組成信號肽，成熟肽段長154個氨基酸。雞IL-10與人IL-10以及鼠IL-10 的氨基酸序列同源性分別為45%和42%。雞基因組DNA 中IL-10 基因包含5 個外顯子和4個內(nèi)含子，與哺乳動物類似，但其排列更加緊密[2]。

IL-10 對免疫細(xì)胞有多方面的調(diào)節(jié)作用[3]，但對免疫應(yīng)答主要起抑制作用。在有關(guān)HIV的研究中顯示，HIV 刺激樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生IL-10，從而使多種免疫功能受到抑制[4]。相關(guān)研究表明，SPF雞感染禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒后，外周血單核細(xì)胞中的IL-10 的轉(zhuǎn)錄水平會上調(diào)[5]。本研究克隆了雞IL-10 基因，在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，制備了chIL-10 單克隆抗體，并鑒定了單抗特性，為進(jìn)一步研究雞IL-10的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞、質(zhì)粒及實驗動物E.coliDH5α和E.coliRosetta(DE3)，骨髓瘤細(xì)胞SP2/0 和HEK293T細(xì)胞，MDCC-MSB1的cDNA，pGEX-6p-1和pRK5-flag 質(zhì)粒，由本實驗室保存，pET-30 質(zhì)粒由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞與分子生物學(xué)實驗室唐軍教授惠贈；BALB/c 小鼠，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所。

1.2 主要試劑及儀器 弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT、HT 以及免疫球蛋白亞類分析試劑盒，購自Sigma 公司；PEG4000，購自MERCK 公司；DMEM，購自Invitrogen 公司；胎牛血清，購自HyClone 公司；非必須氨基酸，購自Gibico 公司；鼠源His-tag 以及GST-tag 單抗，購自Abmart 公司；flag-tag單抗，購自Sigma 公司；HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 以及HRP 標(biāo)記馬抗山羊IgG，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；壓力攪拌式濃縮杯，購自默克化工技術(shù)(上海)有限公司；酶標(biāo)板，購自美國Costar 公司；酶標(biāo)儀，購自美國TECAN公司。

1.3 原核表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白純化 以MDCCMSB1的cDNA 為模板，根據(jù)NCBI 上發(fā)布的禽源IL-10 序列(NM_001004414.2)設(shè)計引物：F-5′-TTGGAGCCCACCTGCCTGCACTTCT-3′ ；R-5′-TCACTTCCTCCTCCTCATCAGCAGG-3′擴增去除chIL-10基因中編碼信號肽的部分，分別構(gòu)建到pET-30a和pGEX-6p-1 原核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)進(jìn)行表達(dá)，提取的包涵體按照文獻(xiàn)[6]所述方法進(jìn)行稀釋復(fù)性，獲得重組蛋白。

1.4 chIL-10 單克隆抗體的制備 小鼠免疫程序按文獻(xiàn)[7]所述方法進(jìn)行。細(xì)胞融合、陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選按文獻(xiàn)[8]所述方法進(jìn)行。腹水的制備和純化按文獻(xiàn)[8-9]所述方法進(jìn)行。

1.5 chIL-10單克隆抗體的鑒定

1.5.1 單克隆抗體Ig 亞類鑒定 按照Sigma 公司的小鼠單抗亞類鑒定試劑盒說明書進(jìn)行單抗重鏈亞類的鑒定。

1.5.2 單克隆抗體親和力的測定 利用間接ELISA 方法測定單抗的親和力：以2 μg/mL GSTchIL-10蛋白包被酶標(biāo)板，封閉后加入倍比稀釋純化的單抗，以HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，酶標(biāo)儀讀取OD450nm 吸光值。數(shù)據(jù)的處理分析按照文獻(xiàn)[10]所述方法。

1.5.3 單克隆抗體的特異性鑒定 以原核表達(dá)的重組雞白介素10(His-chIL-10)，雞白介素2(His-chIL-2)，雞白介素4(His-chIL-4)，雞干擾素beta(His-chIFN-β)為抗原，經(jīng)SDS-PAGE 后轉(zhuǎn)印至PVDF 膜；分別以His-tag 單抗和純化的1E3、4F3以及4B2 chIL-10 單抗為一抗；以HRP-山羊抗小鼠IgG為二抗；以化學(xué)發(fā)光法暴光感光膠片。

1.5.4 單克隆抗體識別真核細(xì)胞表達(dá)的chIL-10 將消化好的HEK293T細(xì)胞，按照每孔大約8×105個細(xì)胞接種于6 孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時，按照Vigofect 的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染pRK5-flag-chIL-10 試驗組和pRK5-flag 對照組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24 h 后收取細(xì)胞蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 后轉(zhuǎn)印至PVDF 膜；分別以flag-tag 單抗、純化的1E3、4F3 以及4B2 chIL-10 單抗為一抗；以HRP-山羊抗小鼠IgG為二抗；以化學(xué)發(fā)光法暴光感光膠片。

1.5.5 單克隆抗體抗原識別區(qū)的確定 以chIL-10 不同截短的重組蛋白為抗原，以制備的單抗為一抗，通過Western Blot 分析兩株單抗可能識別的抗原表位所在區(qū)域。

2 結(jié)果

2.1 chIL-10單克隆抗體的制備及特異性鑒定 如圖1所示，3株單抗純化效果較好且均能特異識別原核表達(dá)的chIL-10。

2.2 單克隆抗體亞類鑒定及親和力測定 4B2、4F3 與1E3 雜交瘤細(xì)胞株分泌的單抗亞類分別為IgG2a、IgG2a 和IgG1。3 株單抗親和力解離常數(shù)(Kd)分別為1.05×10-9、5.01×10-10以及7.59×10-10(圖2)，均屬于高親和力抗體。

2.3 單克隆抗體識別真核細(xì)胞表達(dá)的chIL-10 如圖3 所示，3 株單抗均能識別真核表達(dá)的chIL-10。

2.4 單克隆抗體抗原識別區(qū)的確定 用分子生物學(xué)技術(shù)將chIL-10 蛋白截短并在原核細(xì)胞中表達(dá)，用Western Blot 方法檢測3 株單抗對于截短蛋白的識別情況，4B2、4F3 識別的抗原區(qū)域為chIL-10 N-端的1 aa～52 aa，1E3 識別的抗原區(qū)域為chIL-10 N-端的52 aa～102 aa。

圖1 單抗的純化和特異性鑒定

圖2 chIL-10單克隆抗體親和力測定

3 討論

樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞等細(xì)胞可以分泌IL-10，然而Th2 細(xì)胞是分泌IL-10 的主要來源[11-13]。IL-10 能夠抑制Th1 細(xì)胞因子譬如IL-2與IFN-γ的合成[14]。IL-10 抑制單核/巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，并因此抑制了LPS 和IFN-γ誘導(dǎo)其分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、G-CSF 和GM-CSF[15]。此外，IL-10可以阻止B 細(xì)胞凋亡，增強其增殖、分化和MHC II 類分子的表達(dá)，而且在Ig 類別轉(zhuǎn)換中起著積極的作用[16]。淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)感染早期可以誘導(dǎo)IL-10的表達(dá)，引起免疫抑制，使病毒逃離機體的免疫機制，而長期持續(xù)性存在于體內(nèi)[17]。由此可見，IL-10 在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，并與病毒的持續(xù)性感染有關(guān)。

圖3 單克隆抗體識別真核細(xì)胞表達(dá)的chIL-10

圖4 單抗抗原表位識別區(qū)分析

目前國內(nèi)外對雞IL-10 的研究還很少，檢測其含量動態(tài)變化還停留在mRNA 水平，還未見在蛋白水平上檢測雞IL-10 的報道。本研究獲得的3 株雜交瘤細(xì)胞株(4B2，4F3，1E3)，產(chǎn)生的chIL-10 單抗識別chIL-10 不同的區(qū)域，并且都能識別真核表達(dá)的chIL-10，為制備chIL-10 的檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)，也為深入研究chIL-10 的生物學(xué)作用奠定了基礎(chǔ)。

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Development and identification of monoclonal antibodies against chIL-10

GAO Jun-Feng ， LIU Ya-nan ， WANG Yong-qiang ， CAO Hong ， LI Xiao-qi ， ZHENG Shi-jun

(State Key Laboratory of Agrobiotechnology and College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China)

To develop monoclonal antibodies(McAbs)against chIL-10，chicken interleukin-10(mch-10)gene was cloned into a pET-30a vector，and the protein was expressed inE.coliand purified with affinity Chromatography.We immunized BALB/c mice with the purified protein，and fused murine splenocytes with SP2/0.An indirect ELISA using GST-mchIL-10 protein as coating antigen was established to screen positive clones. We obtained 3 hybridoma cell clones that stably secreted McAbs against chIL-10 and these clones were named 4B2，4F3 and 1E3，respectively.The titers in ascite fluid were 1:3.2×106.The dissociation constants(kDs)were 1.05×10-9，5.01×10-10，and 7.59×10-10，respectively.The isotypes of these McAbs were determined to be IgG2a，IgG2a and IgG1.These McAbs specifically bound to chIL-10 expressed by either prokaryotic or eukaryotic system as demonstrated by Western Blot.The binding domain of chIL-10 recognized by 4B2，4F3 was located between 1-52aa，and that by 4B2 was located between 52-102aa as determined by Western Blot.These McAbs would help to detect chIL-10 and to elucidate the biological roles of chIL-10 in immune responses.

chicken interleukin-10 ； prokaryotic expression ； monoclonal antibody

s:ZHENG Shi-jun ； LI Xiao-qi

2015-08-11

國家自然科學(xué)基金(31272543)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(NYCYTX-41)

高俊峰(1990-)，男，博士生，主要從事病原與宿主相互作用機制的研究，E-mail：jfgao@cau.edu.cn

鄭世軍，E-mail：sjzheng@cau.edu.cn；李曉齊，E-mail：leexiaoqi@cau.edu.cn

S852.4

A

0529-6005(2016)12-0003-04