劉茂生鄭燕吳水梅李騰政鐘思思郭武華謝正元

·基礎(chǔ)研究·

GTP結(jié)合蛋白4在肝癌中的表達(dá)及作用的初步研究*

劉茂生①鄭燕①吳水梅①李騰政①鐘思思②郭武華①謝正元①

目的：探討GTP結(jié)合蛋白4（GTP binding protein 4，GTPBP4）在肝癌（hepatocelluar carcinoma，HCC）組織中的表達(dá)及沉默GTPBP4對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖和周期影響。方法：收集南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院2014年3月至2015年2月24例新鮮臨床HCC組織及配對(duì)癌旁組織標(biāo)本，采用Western blot檢測(cè)GTPBP4在組織中的表達(dá)差異；在HepG2細(xì)胞中用慢病毒介導(dǎo)的RNAi干擾技術(shù)沉默該基因，運(yùn)用熒光顯微鏡觀(guān)察感染效率，Western blot、RT-qPCR檢測(cè)沉默效果；CCK-8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀觀(guān)察細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期變化。結(jié)果：1）Western blot結(jié)果顯示GTPBP4在21例（87.5％）HCC組織標(biāo)本中明顯高表達(dá)（P＜0.000 1）；2）用熒光顯微鏡觀(guān)察顯示慢病毒成功感染HepG2細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)90％細(xì)胞表達(dá)GFP；LV-GTPBP4-RNAi組GTPBP4在RNA水平、蛋白水平較對(duì)照組分別下降約70％和67％；3）GTPBP4基因沉默96 h后，LV-GTPBP4-RNAi組增殖能力抑制，抑制率約54.51％；LV-GTPBP4-RNAi組G0/G1期增多，S期減少，細(xì)胞周期發(fā)生停滯。結(jié)論：GTPBP4在HCC組織中高表達(dá)，利用RNAi干擾GTPBP4基因表達(dá)后，人肝癌HepG2細(xì)胞增殖能力明顯下降，細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，但是具體分子機(jī)制不明。

肝癌GTPBP4增殖

肝癌在我國(guó)腫瘤總體發(fā)病率為第4位，死亡率為第3位［1］，其中肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占肝癌85％～90％［2］。盡管已有大量研究闡述其分子機(jī)制，但仍有許多重要分子機(jī)制不明。GTP結(jié)合蛋白4（GTP binding protein 4，GTPBP4）是一種定位于核仁的新型G蛋白［3］，主要參與60S亞單位的合成［4］和成熟［5］，該蛋白與細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)密切相關(guān)。目前，對(duì)于該基因在腫瘤中的研究較少，僅少量文獻(xiàn)提示該蛋白和乳腺癌［6-7］、神經(jīng)膠質(zhì)瘤［8］等腫瘤有關(guān)。本課題組研究GTPBP4在HCC組織中的表達(dá)情況，并通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)沉默基因，觀(guān)察該基因沉默對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖、周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌HepG2細(xì)胞（購(gòu)自中國(guó)凱基生物技術(shù)公司），總蛋白抽提試劑盒（購(gòu)自中國(guó)北京普利萊基因有限公司），Trizol抽提試劑（購(gòu)自中國(guó)全式金有限公司），RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購(gòu)自日本TAKARA公司），熒光定量試劑盒（購(gòu)自日本TAKARA公司），CCK-8試劑（購(gòu)自中國(guó)全式金有限公司），細(xì)胞周期試劑盒（購(gòu)自中國(guó)凱基生物技術(shù)公司），兔多克隆抗體GTPBP4（購(gòu)自中國(guó)武漢proteintech公司），鼠多克隆抗體GAPDH（購(gòu)自中國(guó)武漢proteintech公司），辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗兔、山羊抗鼠（購(gòu)自中國(guó)全式金有限公司），GTPBP4、GAPDH正反義鏈引物（購(gòu)自上海生物工程設(shè)計(jì)合成），攜帶表達(dá)GFP的GTPBP4小干擾RNA的重組慢病毒（LV-GTPBP4-RNAi）（由上海吉?jiǎng)P公司篩選、構(gòu)建并包裝），胎牛血清（購(gòu)自中國(guó)Gibco公司）。

1.2 方法

1.2.1 新鮮組織收集南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院2014年3月至2015年2月肝膽外科行肝癌切除術(shù)，在未影響病理診斷前提下，于離體半小時(shí)內(nèi)取癌組織、距癌旁至少2 cm以上肝組織小塊狀標(biāo)本，液氮運(yùn)輸并凍存于-80℃冰箱中。收集標(biāo)本均取得患者或家屬同意并簽署知情同意書(shū)。該研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。新鮮組織納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：病理類(lèi)型必須為HCC，膽管細(xì)胞性肝癌、混合型肝癌及轉(zhuǎn)移性肝癌不納入本實(shí)驗(yàn)。所有納入患者術(shù)前未接受任何放化療、介入手術(shù)等治療。共收集符合標(biāo)準(zhǔn)24例標(biāo)本，其中男性21例，女性3例；年齡34～76歲，平均年齡（54.0±10.7）歲；HBsAg陽(yáng)性19例；腫瘤直徑1.5～18cm，直徑≥5 cm 13例；合并肝硬化10例；9例患者血清AFP＞200 ng/mL，AFP正常者7例（正常值＜8.1 ng/mL）。

1.2.2 組織總蛋白提取稱(chēng)取30 mg肝細(xì)胞癌組織/癌旁組織，加入1 mL裂解液，手動(dòng)勻漿研磨，加入2倍體積的抽提試劑，混勻，室溫靜置10 min，4℃1 000 r/min離心10 min，保留中間白色蛋白膜并室溫干燥，加入適量2％SDS溶解，95℃變性10 min-震蕩-室溫冷卻30min，4℃、12000r/min離心5min，取蛋白上清，定量。

1.2.3 重組慢病毒感染肝癌HepG2細(xì)胞消化重懸HepG2細(xì)胞，將3×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合度達(dá)40％～50％，分別用LV-GTPBP4-RNAi、LV-NC組感染HepG2細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為10，polybrene終濃度為5 μg/mL。12 h后更換新鮮完全培養(yǎng)基，72 h后用熒光顯微鏡觀(guān)察GFP表達(dá)情況，并計(jì)算慢病毒轉(zhuǎn)染效率。對(duì)照組為無(wú)關(guān)干擾片段病毒LV-Negative control（LV-NC）。LVGTPBP4-RNAi靶序列為5'-AACCGTTATTCATAAA CAT-3'，LV-NC無(wú)關(guān)序列為5'-TTCTCCGAACGTGT CACGT-3'。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR慢病毒感染后第5 d，用Trizol試劑常規(guī)提取LV-GTPBP4-RNAi組、LV-NC組細(xì)胞總RNA，用核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)總RNA濃度及純度，根據(jù)TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逐步加入逆轉(zhuǎn)錄成分及用量，逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取適量的cDNA進(jìn)行下一步熒光定量，根據(jù)TAKARA熒光定量試劑盒的說(shuō)明書(shū)，逐步加入成分用量，本實(shí)驗(yàn)采用20 μL體系。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)循環(huán)設(shè)置如下：預(yù)變性1個(gè)循環(huán)（95℃預(yù)變性30 s）；40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（95℃5 s；61℃退火30 s），進(jìn)行熒光信號(hào)的采集；溶解曲線(xiàn)建立，采集熒光信號(hào)。GTPBP4引物正義鏈序列5'-GGACGGATGTGCACA GTGAT-3'，反義鏈5'-TCTGCTCTCGTCACCTTGTT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為173 bp；GAPDH引物正義鏈序列5'-GTTGGAGGTGGGAGTCAACGGA-3'，反義鏈序列5'-GAGGGATCTCGCTCCTGGAGGA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為240 bp。熒光定量結(jié)果按2-△△CT計(jì)算并比較兩組的mRNA表達(dá)量。

1.2.5 細(xì)胞總蛋白提取變性10 min，蛋白定量慢病毒感染后第5 d，棄培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS洗滌3遍，加入細(xì)胞裂解液300 μL，冰上靜置裂解30 min用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，轉(zhuǎn)移至微量離心管中；4℃12000r/min，離心15min；取上清，100℃煮沸。

1.2.6 Western blot檢測(cè)將組織、細(xì)胞總蛋白抽提后，加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮10 min，低溫冷卻，取適量進(jìn)行SDS-PAGE電泳（8％分離膠、5％濃縮膠），電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫下用含5％脫脂牛奶封閉液封閉2 h，TBST漂洗5 min，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，15 min換液1次。加入二抗，室溫下孵育80 min，TBST漂洗3次，15 min換液一次，在暗室下進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、壓片、顯影、定影。應(yīng)用Image J軟件測(cè)量GTPBP4、GAPDH灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 CCK-8實(shí)驗(yàn)慢病毒感染HepG2細(xì)胞后第5 d，用0.25％胰蛋白酶消化重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/mL，分別將LV-GTPBP4-RNAi、LV-NC組細(xì)胞種板于96孔板內(nèi)，每孔2×103個(gè)/孔，感染后96 h每孔加入CCK-8試劑10 μL，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的OD值并記錄。

1.2.8 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)慢病毒感染后第7 d，胰酶消化并收集細(xì)胞，用PBS液洗滌并重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度均調(diào)整為2×106/mL，取1 mL單細(xì)胞懸液。單細(xì)胞懸液離心去上清，加入1 mL 70％的預(yù)冷乙醇，4℃固定過(guò)夜。染色前用PBS洗滌2次，加入100μL的RNase A，37℃水浴30 min。再加入500 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液混勻，4℃避光反應(yīng)30 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處的紅色熒光，采集并記錄各組細(xì)胞DNA數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。配對(duì)樣本比較采用t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC組織標(biāo)本GTPBP4表達(dá)情況

GTPBP4在21例（87.5％）HCC組織表達(dá)量較高，在3例HCC組織及癌旁組織表達(dá)無(wú)明顯差異，提示GTPBP4蛋白表達(dá)量在HCC組織中過(guò)表達(dá)，與癌旁組織差異明顯（圖1）。

A.Representative images showing GTPBP4 protein expression in eight paired HCC tissues and adjacent noncancerous liver tissues;B.The relative protein expression of GTPBP4 is more significantly elevated in the 24 paired HCC tissues than in adjacent noncancerous liver tissues.(***. P＜0.000 1)圖124對(duì)HCC組織及配對(duì)癌旁組織中GTPBP4蛋白表達(dá)情況Figure 1Protein expression of GTPBP4 in 24 HCC tissues compared with their adjacent noncancerous liver tissues

2.2 GTP表達(dá)

重組慢病毒感染HepG2細(xì)胞72 h后，用倒置熒光顯微鏡觀(guān)察GFP表達(dá)情況，顯示LV-GTPBP4-RNAi組、LV-NC組細(xì)胞90％以上表達(dá)陽(yáng)性，感染效率高（圖2）。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot在RNA水平、蛋白水平檢測(cè)表達(dá)顯示，LV-GTPBP4-RNAi組RNA水平較LV-NC組下降約70％（圖3A），蛋白水平下降約67％（圖3B），能有效沉默GTPBP4基因的表達(dá)。

2.3 細(xì)胞增殖能力

慢病毒感染HepG2細(xì)胞后，LV-GTPBP4-RNAi組、LV-NC組的平均OD值分別為0.766±0.077、1.684±0.147，抑制率約54.51％（圖4）。GTPBP4沉默后HepG2細(xì)胞增殖能力受抑制。

2.4 細(xì)胞周期變化

A.Optical microscope×100;B.Green expression×100圖2慢病毒感染72 h后，在熒光倒置顯微鏡下觀(guān)察GFP表達(dá)情況Figure 2At 72 h after lentivirus with GFP reporter infected the Hep G2 cells,GFP expression was observed under a fluorescence microscope

A.RT-qPCR analysis(***.P＜0.000 1);B.Western blot analysis圖3實(shí)驗(yàn)組RNAi有效干擾沉默GTPBP4基因表達(dá)Figure 3Silencing efficiency after transfection with LV-GTPBP4-RNAi. LV-GTPBP4-RNAi effectively reduced the relative expression of GTPBP4 at both mRNA and protein levels

經(jīng)慢病毒感染、胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)LV-GTPBP4-RNAi組G0/ G1期增多，S期減少，細(xì)胞周期停滯在G0/G1期（圖5）。

圖4 CCK-8實(shí)驗(yàn)的光密度值Figure 4Optical density was measured in cell counting kit-8 assay

A.Cell-cycle analysis was performed via propidium iodide staining;B.G0/ G1,S,and G2/M ratios in HepG2 cells.*.P＜0.01;#.P＞0.05圖5LV-NC、LV-GTPBP4-RNAi組細(xì)胞周期結(jié)果Figure 5Results of cell cycle after silencing GTPBP4

3 討論

肝癌發(fā)病隱匿，進(jìn)展速度快，預(yù)后差。肝癌的外科切除、肝臟移植最為有效，但5年生存率較差，行外科切除術(shù)后，特別是合并肝硬化患者，5年再?gòu)?fù)發(fā)率或轉(zhuǎn)移達(dá)70％以上［9-10］。已有較多研究，闡述肝癌發(fā)生的分子機(jī)制并在此基礎(chǔ)上研發(fā)出具有前景的分子靶向藥物，且在臨床藥物驗(yàn)證中取得較好效果，其中最受矚目的是多激酶抑制藥物索拉菲尼［11］。分子靶向藥物的研發(fā)開(kāi)啟了治療肝癌的新大門(mén)，仍有大量的分子機(jī)制未明，進(jìn)一步了解肝癌發(fā)生機(jī)制和尋找可能的藥物靶點(diǎn)具有重要意義。

G蛋白是指與鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合，具有GTP水解酶活性的一類(lèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，具有結(jié)合GTP或GDP的能力、GTPase酶活性［12］，其主要分為2類(lèi)［13］：1）異三聚體G蛋白，多數(shù)存在于細(xì)胞膜上，根據(jù)α亞單位不同，將G蛋白分為4類(lèi)：Gs、Gi、Gq、G12；2）小G蛋白，存在于質(zhì)膜或胞液中，至少細(xì)分為Ras、Rho、Rab、Arf/Sar和Ran 5個(gè)亞家族［14］。GTPBP4也稱(chēng)為慢性腎功能衰竭蛋白（chronic renal failure gene protein，CRFG），GTP-binding protein NGB，NOG1，是由10號(hào)染色體長(zhǎng)臂14-15區(qū)（10q15-14）編碼的一種由633個(gè)氨基酸組成定位于核仁的新型G蛋白，結(jié)合分子量及蛋白結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)其不屬于上述兩大類(lèi)，該蛋白的GTP結(jié)合區(qū)域及序列和OBG、DRG蛋白極度相似，組成新的G蛋白亞家族，命名為ODN［3，8］。當(dāng)前，對(duì)于該基因的研究較少，許多機(jī)制功能需要進(jìn)一步研究，目前研究顯示該蛋白主要參與核糖體60s亞基的合成和成熟，還和腎病末期的發(fā)展有密切關(guān)系［15-16］。但是對(duì)于該基因和腫瘤的關(guān)系研究較少。

有研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中表達(dá)水平下調(diào)，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒表達(dá)上調(diào)后，施旺細(xì)胞生長(zhǎng)、DNA合成及裸鼠成瘤能力下降，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GTPBP4蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)Merlin蛋白、Cyclin D1蛋白抑制細(xì)胞增殖，起抑癌基因角色［8］。但也有研究和上述結(jié)果相悖，乳腺癌GTPBP4表達(dá)量高者的生存期較短［6-7］，提示該蛋白可能在腫瘤分子中承擔(dān)潛在癌基因角色。此外，果蠅P53蛋白與全基因譜內(nèi)的蛋白相互作用時(shí)，GTPBP4選擇性結(jié)合P53家族中P53蛋白，通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖、周期均出現(xiàn)不同程度的變化［17］。綜上所述，該蛋白和細(xì)胞的增殖、活力相關(guān)，但是具體的分子機(jī)制不明。國(guó)內(nèi)外尚較少報(bào)道該基因在HCC組織中的具體情況，本實(shí)驗(yàn)探索性研究GTPBP4在HCC組織中的表達(dá)情況，并發(fā)現(xiàn)GTPBP4表達(dá)水平在HCC組織中明顯偏高。對(duì)于該蛋白在HCC組織中表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象，進(jìn)行后續(xù)干擾實(shí)驗(yàn)，采用RNAi技術(shù)沉默GTPBP4表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制，細(xì)胞周期明顯停滯，提示該基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)增殖能力參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，GTPBP4在HCC中可能通過(guò)某種機(jī)制調(diào)控細(xì)胞周期、影響細(xì)胞增殖，促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展。但本研究由于樣本量較少，缺少該基因和臨床密切相關(guān)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)研究，如生存期、分化程度及血管侵襲、肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移等。此外該蛋白調(diào)控HCC細(xì)胞增殖和周期的具體分子機(jī)制不明,GTPBP4功能和小G蛋白更類(lèi)似，小G蛋白中Ras、Rho家族和腫瘤關(guān)系最為密切，Ras家族可激活一系列效應(yīng)酶，如Raf蛋白激酶家族、PI3K家族、PLC等，Rho家族觸發(fā)部分效應(yīng)酶，如JNK、Cyclin D1、CDKI等，GTPBP4是否也通過(guò)上述效應(yīng)酶調(diào)控HCC細(xì)胞增殖和周期需要更深的探討。

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（2016-07-18收稿）

（2016-10-19修回）

（編輯：周曉穎 校對(duì)：張抿）

Expression of GTPBP4 in hepatocelluar carcinoma(HCC)tissues and preliminary study on the functions of the GTPBP4 gene

Maosheng LIU1,Yan ZHENG1,Shuimei WU1,Tengzheng LI1,Sisi ZHONG2,Wuhua GUO1,Zhengyuan XIE1

Zhengyuan XIE;E-mail:xzyxzy1230@163.com
1Department of Gastroenterology,The Second Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China;2Gradual School in Medicine College of Nanchang University,Nanchang 330006,China
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81360074)

Objective:To investigate the protein expression of GTPBP4 in human hepatocelluar carcinoma(HCC)tissues and the influence of GTPBP4 silencing by siRNA on the proliferation and cell cycle of HCC cell line Hep G2.Methods:Western blot analysis was performed to observe the protein expression of GTPBP4 in 24 cases of HCC tissues compared with their adjacent noncancerous liver tissues.Lentivirus-mediated RNA interference(RNAi)was used to silence GTPBP4 expression in Hep G2,and the infection efficiency was observed under a fluorescence microscope.The silencing effect was tested by Western blot and real-time PCR.After silencing the GTPBP4 gene,cell proliferation was detected using CCK-8 assay,and the cell cycle was observed using flow cytometry.Results:(1)GTPBP4 was overexpressed in 21 cases(87.5％)of HCC tissues(P＜0.000 1).(2)After the lentivirus with GFP reporter infected the Hep G2 cells,90％of the cells showed green fluorescence.LV-GTPBP4-RNAi effectively inhibited the expression of GTPBP4 at both mRNA(70％) and protein(67％)levels.(3)The proliferation ability of the LV-GTPBP4-RNAi group significantly decreased after 96 h(inhibition rate: 54.51％).Flow cytometry showed that the LV-GTPBP4-RNAi group significantly increased at the G0/G1phase,whereas the S phase decreased and arrested at the G0/G1phase.Conclusion:GTPBP4 overexpression in HCC tissues was associated with hepatocarcinogenesis and promoted tumor cell proliferation,but the specific molecular mechanisms remain to be investigated.

hepatocellular carcinoma,GTPBP4,proliferation

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.24.836

①南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（南昌市330006）；②南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究生院

*本文課題受?chē)?guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81360074）資助

謝正元xzyxzy1230@163.com

劉茂生專(zhuān)業(yè)方向?yàn)楦闻K疾病的基礎(chǔ)研究。

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