高曉明，郭永峰

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

煙草重要基因篇16：

煙草葉片衰老相關(guān)基因

高曉明，郭永峰*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

煙草（Nicotiana tabacum L.）是一種葉用經(jīng)濟作物，以成熟變黃的葉片為收獲對象，其葉片成熟度和葉片變黃過程對煙葉產(chǎn)品的質(zhì)量起到?jīng)Q定性的影響。簡述了植物葉片衰老相關(guān)基因的研究概況，歸納了近年來煙草中葉片衰老調(diào)控相關(guān)基因的研究進展，總結(jié)了部分外源基因?qū)煵萑~片衰老的影響。分析表明，研究煙草葉片衰老相關(guān)基因，對提高煙葉品質(zhì)和煙草育種具有重要意義。

煙草；葉片衰老；調(diào)控基因

衰老是植物生長發(fā)育的最后一個階段，植物衰老是植株在細胞、組織、器官或整株水平上生長衰退的過程，它由基因調(diào)控并受內(nèi)外因素的影響，最終導(dǎo)致整株植物的死亡［1］。葉片衰老是植物衰老的主要表現(xiàn)形式，在正常條件下，葉片衰老主要與葉片年齡有關(guān)，是葉片的自然衰老。除此之外，葉片衰老也可以被一系列外部環(huán)境因素如光照不足、干旱、極端溫度、病原體物侵染等誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)。葉片衰老還與植物激素水平有密切的關(guān)系，植物內(nèi)源激素如細胞分裂素、赤霉素等具有延緩衰老的作用，而乙烯、脫落酸、茉莉酸、水楊酸等則具有促進衰老的作用。葉片衰老過程中，葉綠體是第一個被分解的細胞器，因葉綠素降解導(dǎo)致的葉片黃化是葉片衰老的主要標志。葉綠體被分解之后，葉片的光合效率下降，其降解產(chǎn)物形成豐富的氮源，此時葉片的主要功能不再是進行光合作用，而是將蛋白質(zhì)、脂肪、核酸等生物大分子降解形成的氮素及其它營養(yǎng)元素輸送至莖尖、果實、幼葉等新生器官，供進一步生長發(fā)育或儲存［2-5］。

1　植物葉片衰老相關(guān)基因研究概述

葉片衰老是一種程序性細胞死亡（programmed cell death，PCD），是細胞在一定的生理條件下，為更好的適應(yīng)生存環(huán)境而發(fā)生的一種由基因控制的細胞自主有序死亡的過程［6］。程序性細胞死亡涉及一系列基因的激活、表達及調(diào)控。在此過程中，許多參與代謝及信號感知的基因，特別是轉(zhuǎn)錄因子以及它們的下游信號基因的表達都會發(fā)生變化。目前人們已經(jīng)從擬南芥、水稻等模式植物中克隆出大量與衰老相關(guān)的基因，根據(jù)它們在葉片衰老期間表達量的變化，可分為衰老下調(diào)基因（senescence-down regulated genes，SDGs）和衰老上調(diào)基因，也叫做衰老相關(guān)基因（senescence-associated genes，SAGs）。大量與植物光合作用、生物合成相關(guān)的基因隨葉片衰老表達量下調(diào)，如編碼與光合過程有關(guān)的蛋白質(zhì)、葉綠素a/b結(jié)合蛋白、rbcL/rbcS（2，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大/小亞基）、電子傳遞體（petB）、光合系統(tǒng)Ⅱ（psbA）的基因等［7］。葉片衰老過程伴隨著大量的大分子化合物降解及降解產(chǎn)物的回收再利用，許多編碼蛋白酶及參與營養(yǎng)物質(zhì)分解代謝及轉(zhuǎn)運蛋白的基因會隨葉片衰老過程表達上調(diào)［8-9］，大部分衰老上調(diào)基因在葉片生長初期可以檢測到較低水平的表達，隨著葉片衰老的發(fā)展，其表達量不斷升高。還有一小部分衰老上調(diào)基因，只有在葉片衰老時期才能檢測到，為高度衰老特異基因，如SAG12、SAG13［10］、LSC54［9］等。此外，對擬南芥葉片衰老轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，有很多轉(zhuǎn)錄因子家族在葉片衰老調(diào)控中起到非常重要的作用，常見的包括NAC家族轉(zhuǎn)錄因子、WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子、C2H2鋅指蛋白家族、AP2/ERFs家族、MYBs家族、homebox蛋白家族、bZIPs家族、bHLHs家族和C3H鋅指蛋白家族等［11］。

目前，有關(guān)植物葉片衰老調(diào)控的分子機理的研究已經(jīng)取得不少成果，大多數(shù)集中在葉片衰老相關(guān)基因的鑒定及功能分析上，也有利用基因工程手段，在延緩植物葉片衰老特性上取得了一定的成果。目前關(guān)于葉片衰老信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究已成為熱點。

2　煙草葉片衰老相關(guān)基因研究進展

2.1煙草葉片衰老相關(guān)基因

煙草中NtCP1和NtCP2是編碼半胱氨酸蛋白酶的基因，其中NtCP1是高度衰老特異表達基因，只在自然衰老的煙草葉片中表達，并且無法被不良環(huán)境條件等誘導(dǎo)，是煙草中一個非常好的衰老標記基因；NtCP2在成熟的煙草葉片中表達，但在衰老葉片中表達下調(diào)，其表達量受干旱和高溫的影響顯著，干旱或高溫處理后表達下調(diào)［12］。NtCP23和MC也是編碼半胱氨酸蛋白酶的基因，其中NtCP23與NtCP1的表達模式相似，呈衰老上調(diào)表達，但在葉片生長發(fā)育的初期也能檢測到NtCP23的表達；MC在葉片生長發(fā)育初期的表達量最高，隨葉片衰老其表達量逐步下降［13］。這些蛋白酶編碼基因可能參與了葉片衰老過程中蛋白質(zhì)的降解過程。

衰老葉片中的氮素一般在細胞之中通過谷氨酸合成循環(huán)轉(zhuǎn)換成谷氨酰胺，以谷氨酰胺的形式通過維管束運輸?shù)接兹~及生殖器官中，以達到氮素再利用的目的［11］。NtGln1-3是煙草中一個與氮素再利用相關(guān)的基因，編碼谷氨酰氨合成酶，其轉(zhuǎn)錄本在葉片生長發(fā)育初期較高，在成熟葉片中檢測不到，但在衰老葉片中再次積累［13-14］。谷氨酸脫氫酶編碼基因NtGDH1和NtGDH2也是煙草中谷氨酸合成循環(huán)相關(guān)的基因，NtGDH1和NtGDH2的表達量在成熟期和衰老早期的葉片中極低，而在衰老后期的葉片中達到最高［13］。

NtPSA1編碼 26S蛋白酶體的非催化型亞基，在植物葉片和花衰老過程中的不同階段，NtPSA1在不同組織中的表達量存在差異，其中在生長旺盛的組織中表達量較高，而在衰老的葉片和花中表達量較低［13，15］。

NtH1N1和NtH1N18是煙草中多胺信號的響應(yīng)因子，在煙草葉片和花衰老過程中表達量顯著上調(diào)，多胺可導(dǎo)致煙草的線粒體功能紊亂［16］。

煙草ndhF基因缺失突變體具有比野生型煙草晚衰30 d以上的表型，ndhF基因編碼Ndh復(fù)合體，該復(fù)合體能夠增加電子轉(zhuǎn)運蛋白的還原程度并促進活性氧生成，導(dǎo)致葉綠體功能紊亂，從而促進葉片衰老［17］。

CYP82E4是煙草 P450家族基因，它編碼的P450蛋白控制煙草中煙堿和去甲基煙堿的轉(zhuǎn)化，研究表明CYP82E4隨葉片衰老表達量顯著上調(diào)［18］。

2.2其他基因?qū)煵萑~片衰老的調(diào)控

異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（isopentenyl-transferases，ipt）是合成細胞分裂素的關(guān)鍵酶，1984年，Barry等［19］率先從根癌農(nóng)桿菌中分離出 IPT基因，1995年，Gan等［20］將SAG12啟動子與IPT基因構(gòu)成的嵌合基因PSAG12-IPT成功轉(zhuǎn)化入煙草，與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因煙草葉片衰老延遲30 d，花數(shù)增加83.7%，生物量增加40.3%，種子數(shù)增加52.4%，但在株高、葉片數(shù)等方面，則與野生型植株無明顯差異。此后，Wingler等［21］對 PSAG12-IPT轉(zhuǎn)基因煙草進行了更加深入的研究，發(fā)現(xiàn)在營養(yǎng)缺乏的情況下，未開花的PSAG12-IPT轉(zhuǎn)基因煙草的部分綠色葉片中由于電子傳遞鏈的過度還原導(dǎo)致光捕獲和能量消耗的不平衡，從而出現(xiàn)壞死斑，而相同生長時期野生型煙草相同葉位的葉片雖已經(jīng)變黃衰老，但未出現(xiàn)壞死斑。此外，Wingler等發(fā)現(xiàn)與發(fā)病相關(guān)的PR-1b和PR-Q基因在PSAG12-IPT轉(zhuǎn)基因煙草的衰老葉片中的表達量顯著高于野生型煙草衰老葉片中的表達量。Ori等［22］發(fā)現(xiàn)PSAG12-kn1轉(zhuǎn)基因煙草與PSAG12-IPT轉(zhuǎn)基因煙草有著類似的衰老表型，揭示出kn1基因除了具有抑制分化的作用之外，也對葉片衰老具有調(diào)控作用［23］。此后，Luo等［24］利用損傷誘導(dǎo)啟動子Win3.12介導(dǎo)kn1的表達，PWin3.12-kn1轉(zhuǎn)基因煙草同樣表現(xiàn)出葉片晚衰的表型。BiP基因編碼一個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子結(jié)合蛋白，BiP過表達轉(zhuǎn)基因煙草植株對干旱脅迫具有更高的耐受力［25］。CKX基因編碼細胞分裂素脫氫酶，最初是在煙草組織的粗提液中檢測到了具有活性的CKX［26］，擬南芥AtCKX2基因過表達煙草植株的抗氧化能力顯著增強，即使在細胞分裂素水平顯著降低的情況下，該轉(zhuǎn)基因煙草也表現(xiàn)出了明顯的晚衰表型［27］。

3　前景與展望

煙草是一種葉用經(jīng)濟作物，收獲對象是成熟變黃的葉片。葉片成熟落黃本身或煙葉成熟度通過影響采收后的烘烤調(diào)制過程對煙葉產(chǎn)品外觀質(zhì)量、物理特性、化學(xué)成分、煙氣特征和卷煙安全性等主要質(zhì)量因素的形成起到?jīng)Q定性的影響。比如，煙葉成熟過程伴隨著葉綠素的降解，葉綠素降解形成煙草致香物質(zhì)的前體物是形成不同特色煙葉的物質(zhì)基礎(chǔ)［28］。作為一個受遺傳控制的發(fā)育過程，葉片衰老的進程可以通過基因突變、遺傳轉(zhuǎn)化及分子標記輔助育種等手段進行調(diào)控。在對控制煙葉成熟落黃及相關(guān)煙葉質(zhì)量因素形成過程的分子機制進行系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，通過鑒定、克隆和調(diào)控?zé)煵萑~片成熟衰老的關(guān)鍵調(diào)控基因及其分子標記，最終可以實現(xiàn)對煙葉成熟落黃過程進行人為干預(yù)，這也是研究特色煙葉形成的理論基礎(chǔ)，對煙草育種和煙葉生產(chǎn)具有重要的實際意義。目前國內(nèi)外植物葉片衰老的研究主要以模式植物擬南芥以及水稻、小麥、棉花等經(jīng)濟作物為對象，而對煙草葉片衰老的研究非常少。深入研究煙草葉片衰老的調(diào)控機理具有重要的理論意義和實踐價值。

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Leaf Senescence Related Genes in Tobacco

GAO Xiaoming， GUO Yongfeng*
（Tobacco Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China）

Tobacco （Nicotiana tabacum L.） is an economic crop in which mature yellow leaves are harvested. Leaf maturity and the ripening process have a decisive influence on the quality of tobacco products. In this article we briefly introduce the research progress of plant leaf senescence related genes. We also summarize the research progress in genes related to tobacco leaf senescence and the effects of exogenous genes on the senescence of tobacco. It is of great importance to study tobacco leaf senescence process and related genes in order to improve the quality of tobacco.

tobacco； leaf senescence； regulating genes

S572

1007-5119（2016）04-0097-04

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.04.017

農(nóng)業(yè)部948項目（2013-Z4）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費增量重點項目（2013ZL024）

高曉明（1984-），助理研究員，主要從事煙草葉片衰老分子調(diào)控研究。E-mail：gaoxiaoming@caas.cn。*通信作者，E-mail：guoyongfeng@caas.cn

2016-07-26

2016-08-12