張銘真，邢雪霞，李曉輝，楊鐵釗，徐世曉

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州 450002）

煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)分析

張銘真，邢雪霞，李曉輝，楊鐵釗，徐世曉*

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州 450002）

發(fā)掘優(yōu)良基因，為改良煙草品種提供理論依據(jù)。采用ABI-3500xl遺傳分析儀對87份煙草種質(zhì)材料進行多態(tài)性檢測。在87份煙草種質(zhì)中，41對SSR引物共檢測出241條多態(tài)性位點，平均為5.88個位點。遺傳相似系數(shù)為0.47～0.91，PIC值為0.23～0.91，平均為0.63。群體結(jié)構(gòu)分析表明，當K=2時，△K值最大，即87份煙草材料可劃分為2個類群P1和P2，P1類群又可劃分為5個亞類，P2類群可劃分為2個亞類。煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富，群體結(jié)構(gòu)劃分與種質(zhì)類型不完全相關(guān)。

煙草；SSR熒光標記；遺傳多樣性；群體結(jié)構(gòu)

煙草是我國重要經(jīng)濟作物之一，目前煙草育種面臨親本匱乏，品種遺傳背景狹窄等問題［1］，亟需加強對種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)的了解。對現(xiàn)有煙草種質(zhì)材料進行遺傳多樣性研究，可以選擇遺傳差異較大的親本配制雜交組合，減少育種工作量，提高育種效率。同時，尋找與目標性狀相關(guān)的分子標記，可以為分子標記輔助育種奠定基礎(chǔ)。當前，分子標記已開始應(yīng)用于作物遺傳資源及育種研究，分別被稱為分子資源鑒定和分子標記育種［2］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，分子標記技術(shù)日趨成熟，目前常用的分子標記有RFLP、SRAP、AFLP、ISSR、SSR等。微衛(wèi)星（亦稱簡單序列重復(fù) simple sequence repeats， SSR）技術(shù)具有多態(tài)性高、數(shù)量豐富、重復(fù)性好、呈共顯性、廣泛分布于基因組等優(yōu)點［3］。Bindle等［4］從Tobacco Genome Initiative公布的煙草基因組序列信息中搜索到282對SSR引物，并利用這些引物構(gòu)建了煙草遺傳連鎖圖。聶瓊等［5］利用SSR和 ISSR技術(shù)分析了23份煙草種質(zhì)遺傳多樣性。文軻等［6］利用SSR技術(shù)，以抗CMV的烤煙品種臺煙8號、感病品種NC82為親本，構(gòu)建BC1代分離群體，篩選到一個與抗性基因相關(guān)的SSR標記，并認為臺煙8號對CMV的抗性是由多基因控制。祁建民等［7］應(yīng)用ISSR技術(shù)，對煙草屬4個種30份材料進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)栽培種內(nèi)的遺傳基礎(chǔ)相對狹窄。陳雅瓊等［8］用36對SSR引物，分析了63份烤煙和8份白肋煙種質(zhì)的遺傳多樣性，也表明我國煙草栽培種間的遺傳基礎(chǔ)狹窄、遺傳多樣性不豐富。陳杰等［9］結(jié)合形態(tài)學(xué)標記和SSR分子標記對 69份烤煙種質(zhì)資源進行遺傳多樣性評價，它們之間的遺傳距離在 0.32～7.83，遺傳相似系數(shù)在0.30～0.96。以往的研究存在研究材料的類型、數(shù)量不足、代表面較窄的問題，因此本研究征集不同類型不同來源的煙草種質(zhì)材料，并基于全自動 DNA遺傳分析系統(tǒng)的 SSR熒光標記檢測技術(shù)，利用Genographer軟件精確定量擴增產(chǎn)物的片段長度，對87份煙草種質(zhì)進行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)研究。確定煙草種質(zhì)材料間的遺傳背景差異與群體結(jié)構(gòu)，為煙草優(yōu)異基因的發(fā)掘、復(fù)雜性狀關(guān)聯(lián)分析以及拓展煙草育種的遺傳基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

87份煙草種質(zhì)資源名稱列于表1，種質(zhì)資源來源于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草育種實驗室和青州煙草研究所。2015年5月取苗期剛長出來的新鮮葉片至于2 mL離心管中液氮冷凍帶回河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草育種實驗室，從液氮中取出放置于-70 ℃超低溫冰箱中保存待用。

1.2煙草總DNA提取和SSR-PCR擴增

樣品離心管置于磨樣機上，待葉片磨碎后于液氮中迅速冷凍，用TaKaRa新型植物基因組DNA提取試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司）提取DNA。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量后保存于-20 ℃冰箱待用。

利用三引物法PCR（在5?端加有M13尾巴序列的特異正向引物、特異反向引物及帶有熒光標記的通用型M13引物，利用毛細管電泳技術(shù)可以同時檢測不同熒光染料標記的多個SSR位點）擴增SSR位點。所用的熒光標記引物是M13-Cy5，序列為5?-CACGACGTTGTAAAACGAC-3?，在合成SSR引物時，在每個正向引物的5?端加上M13尾巴序列，SSR引物由金唯智（蘇州）生物科技有限公司合成。正、反向引物的濃度均稀釋為10 μmol/L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

SSR-PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括：2 μL基因組DNA，0.6 μL Mg2+，1 μL 10×Buffer，0.15 μL dNTP，0.1 μL rTaq酶，帶熒光標記的M13正向引物0.1 μL，正向引物和反向引物各0.05 μL，0.15 μL。PCR程序如下：94 ℃ 5 min預(yù)變性；94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；94 ℃ 30 s；退火溫度各引物不同。

1.3毛細管電泳檢測

PCR產(chǎn)物吸取2 μL于加有6 μL變性劑的384孔板中，95 ℃變性5 min。PCR產(chǎn)物用AB公司Genetic Analyzer 3500 xl儀器進行檢測。試驗結(jié)果用Genographer軟件進行數(shù)據(jù)讀取。

1.4數(shù)據(jù)分析

對Genographer軟件獲得的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為0，1格式，建立原始矩陣后用NTSYS-pc 2.10e［10］軟件進行后續(xù)分析。計算多態(tài)性位點百分率P（%）=（k/n）×100，其中k是多態(tài)位點數(shù)，n為所測位點總數(shù)。SSR位點的多態(tài)性信息量（PIC）按照如下公式進行計算：PIC=1-∑Pi2，公式中Pi表示第i個等位位點出現(xiàn)的頻率。利用 NTSYS-pc Version 2.10e中的Qualitative date模塊計算任意兩個品種間的相似系數(shù)（GS）。以Clustering程序中SHAN進行UPGMA（非加權(quán)組平均法）聚類分析，繪制聚類樹狀圖；利用Structure2.3.4［11］軟件，采用混合模型進行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。

表1　供試材料Table 1 Nicotiana tabacum accession lines investigated in this study

2　結(jié)　果

2.1SSR引物多態(tài)性分析

從80對引物中篩選出41對多態(tài)性較好、擴增帶清晰的引物對87份煙草種質(zhì)進行分析。41對引物在87份煙草種質(zhì)中擴增出241條多態(tài)性條帶。各引物多態(tài)性條帶數(shù)為2～24，平均每對引物能擴增到 5.88個多態(tài)性片段。各引物的 PIC值變幅為0.23～0.91，平均為0.63（表2）。

2.2煙草種質(zhì)資源聚類分析

以41對SSR引物的擴增帶型為基礎(chǔ)，以0，1格式表示，其中數(shù)據(jù)缺失標記為 2，用 NTSYS-pc2.10e軟件進行UPGMA法聚類分析，得出87份種質(zhì)的聚類圖。各種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)范圍為0.47～0.91，其中玉水3號（25）與G70（39）相似系數(shù)最大，為0.91，說明親緣關(guān)系很近；密節(jié)多葉煙（60）與K326（9）之間的相似系數(shù)為0.47，說明這兩品種間的親緣關(guān)系較遠。在相似系數(shù)0.66處，可將87份煙草種質(zhì)分成5大類。贊比亞1號（香料煙）和T.I.245各成一大類，第3類僅包括Criollo Salteno 11和B-1000，兩者間相似系數(shù)為0.69。第4大類由Virgina Gold、Ky151、丸葉、青梗、金英、密節(jié)多葉煙、紅花小黑煙、陳河金堂煙、廣雜87號、Basma Llovina、Vranjska Jaka、督葉尖干種、夏灣那13個品種組成。其他品種構(gòu)成第5大類。在相似系數(shù)0.64處可將87份煙草種質(zhì)分為兩大類；Virgina Gold、Ky151、丸葉、青梗、金英、密節(jié)多葉煙、陳河金堂煙、廣雜87號、Basma Llovina、Vranjska Jaka、督葉尖干種、夏灣那等13個品種為一類，剩余品種為第2類。在不同相似系數(shù)處劃分會得到不同類型，但是這兩種劃分都將烤煙類種質(zhì)聚集為一大類，其中亦會參雜其他類型煙草種質(zhì)。

2.3供試煙草種質(zhì)群體結(jié)構(gòu)分析

本研究利用全基因組41個SSR標記對87份煙草品種進行群體結(jié)構(gòu)分析；假定亞群數(shù)目 K為1～10，每個K值運行5次模擬運算。隨著K值的逐漸增加，軟件輸出的后驗概率LnP（D）值呈連續(xù)上升趨勢，但LnP（D）值最明顯的變化發(fā)生在K由1到2的過程中?！鱇綜合考慮了LnP（D）的變化速率和方差，當K=2時，△K出現(xiàn)峰值（圖1a）。從上述方法判斷，本群體中 87份煙草品種被分成兩個類群，P1和P2（圖1）。P1類群包含50個煙草品系，在P1類群中，群體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，隨著K值的逐漸增加，后驗概率LnP（D）值呈上升趨勢，當K由4 到5時，LnP（D）值變化最為明顯。當K=5時，△K出現(xiàn)了峰值（圖1b）。因此P1類群中檢測到5個亞類群。在P2類群中，群體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，隨著K值的逐漸增加，后驗概率LnP（D）值逐漸上升，當K 由1到2時，LnP（D）值變化最明顯，當K=2時，△K出現(xiàn)了峰值（圖1c）。因此P2類群中檢測到兩個亞類群。煙草87個品種的群體結(jié)構(gòu)示意圖如圖2。

3　討　論

拓寬煙草遺傳基礎(chǔ)，發(fā)掘優(yōu)異基因，改良煙草品種是目前我國煙草育種的首要任務(wù)，而缺乏對種質(zhì)資源遺傳特點的了解是完成這一任務(wù)的最大障礙；目前許多研究者利用各種分子標記技術(shù)探討了煙草資源的遺傳多樣性與親緣關(guān)系。Moon等［12］利用46對SSR引物對54份煙草屬材料進行聚類分析，得到的結(jié)果與基于形態(tài)細胞學(xué)的觀察分類結(jié)果一致。王志德等［13］用43個RAPD引物PCR擴增出214個DNA片段，將24個煙草種質(zhì)分為6大類群，并表明其有高度的遺傳多樣性。梁景霞等［14］用18個ISSR分子標記引物，對96份煙草種質(zhì)進行PCR擴增，共獲得314條穩(wěn)定條帶，并用Nei-Li相似系數(shù)法計算其遺傳相似系數(shù)在0.28～0.97，遺傳多樣性豐富。Patrizia Bogani等［15］利用15對RAPD引物對42個煙草品系進行遺傳多態(tài)性研究，結(jié)果顯示其遺傳距離為0.21到0.92。Ren等［16］用AFLP分子標記分析了41個煙草栽培種和7個野生煙草種的遺傳多態(tài)性，結(jié)果表明，煙草種間遺傳距離在 0.28～0.58，種間遺傳多樣性豐富。本研究所用引物平均PIC值達到0.63，這些引物能在某些煙草種質(zhì)中擴增出特異帶型，由此說明這些引物可用于煙草種質(zhì)遺傳多樣性。本試驗41對SSR引物對87份煙草種質(zhì)的分析結(jié)果表明烤煙內(nèi)的遺傳相似性較高，種間的遺傳差異較大，87份煙草品種包含了烤煙、晾曬煙、白肋煙、雪茄煙和香料煙5個栽培類型，較好地表現(xiàn)出了遺傳多樣性特征，這與以往的研究［17-21］結(jié)果相一致。聚類分析圖顯示，個別品種會偏離原有類型，說明在不同生態(tài)條件下，人為目的的長期選擇逐漸形成了不同栽培類型；個別品種偏離原有類型，和其他類型聚在一起，主要與親源關(guān)系有關(guān)；煙草種質(zhì)間的遺傳差異與品種調(diào)制類型、地理來源的差異沒有較大的聯(lián)系。

圖1　煙草總?cè)后w和不同類群中的后驗概率和△K值Fig. 1 Posterior probability and delta k values of tobacco groups and different groups

圖2　87個煙草品種的群體結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 2 Group structure diagram of 87 tobacco varieties

就中美主要煙草品種親源關(guān)系進行研究，發(fā)現(xiàn)世界主產(chǎn)煙國家的煙草育種也基本在美國育成品種的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，各國的主栽品種都有美國品種的親源成分，我國的煙草育種更不例外［1］；而本研究聚類分析和群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示美國品種資源在不同亞群間出現(xiàn)一定程度的交叉現(xiàn)象。較高的遺傳多樣性是維持物種長期生存的基礎(chǔ)，為提高煙草品種的產(chǎn)量、品質(zhì)及抗性，可以利用生物工程的方法實現(xiàn)野生種優(yōu)良基因向栽培品種轉(zhuǎn)移的目的，從而創(chuàng)造更有利用價值或特殊作用的煙草新品種。

4　結(jié)　論

供試煙草種質(zhì)材料 SSR分子標記揭示了煙草種間存在較豐富的遺傳多樣性，烤煙品種內(nèi)遺傳基礎(chǔ)相對狹窄。少數(shù)品種或類型聚類時出現(xiàn)交叉現(xiàn)象，與其親源關(guān)系有關(guān)，與地理來源及調(diào)制類型關(guān)系不大。本研究可為進一步開展煙草種質(zhì)資源指紋圖譜研究及利用種內(nèi)種間遺傳差異較大的材料拓寬煙草遺傳基礎(chǔ)、發(fā)掘有利基因和改良煙草品種提供理論依據(jù)。

［1］ 王云英，周健. 中美主要煙草品種親源分析與煙草育種［J］. 中國煙草學(xué)報，1995，2（3）：11-22.

［2］ 賈繼增. 分子標記種質(zhì)資源鑒定和分子標記育種［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1995，29（4）：1-10.

［3］ Bhagwat A A， Cregan P B， Akkaya M S. Length polymorphisms of simple sequence repeat DNA in soybean［J］. Genetics， 1992， 132（4）: 1131-1139.

［4］ Bindler G， Plieske J， Bakaher N， et al. A high density genetic map of tobacco （Nicotiana tabacum L.） obtained from large scale microsatellite marker development［J］. Theor Appl Genet， 2011， 123（2）: 219-230.

［5］ 聶瓊，劉仁祥. 23份煙草種質(zhì)遺傳多樣性的SSR和ISSR標記分析［J］. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，24（1）：15-19.

［6］ 文軻，張志明，任民，等. 烤煙CMV抗性基因QTL定位［J］. 中國煙草科學(xué)，2013，34（3）：55-59.

［7］ 祁建民，王濤，陳順輝，等. 部分煙草種質(zhì)遺傳多樣性與親緣關(guān)系的ISSR標記分析［J］. 作物學(xué)報，2006，32 （3）：373-378.

［8］ 陳雅瓊，王衛(wèi)峰，丁安明，等. 基于SSR熒光標記分析我國主要審（認）定烤煙及白肋煙品種遺傳多樣性［J］.中國煙草學(xué)報，2013，19（2）：98-105.

［9］ 陳杰，楊靜，陳建軍，等. 烤煙種質(zhì)資源形態(tài)學(xué)標記及SSR標記的多樣性研究［J］. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，34（4）：450-457.

［10］ Rohlf F J. NTSYSpc: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System Version 2.2 User Guide［M］. New York: Applied Bilstatistics Inc.， 2009.

［11］ Pritchard J K， Stephens M， Donnelly P. Inference of population structure using multilocus genotype data［J］. Genetics， 2000， 7（4）: 574-578.

［12］ Moon H S， Nicholson J S， Lewis R S. Use of transferable Nicotiana tabacum L. microsatellite markers for investigating genetic diversity in the genus Nicotiana［J］. Genome， 2008， 51（8）: 547-559.

［13］ 王志德，牟建民，戴培剛，等. 部分煙草核心種質(zhì)RAPD分析［J］. 中國煙草學(xué)報，2003，9（4）：20-25.

［14］ 梁景霞，祁建民，方平平，等. 煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系的 ISSR聚類分析［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（1）：286-294.

［15］ Patrizia Bogani， Pietro Lio`， Maria Carmela Intrieri， et al. A Physiological and Molecular Analysis of the Genus Nicotiana［J］. Molecular Phylogenetics And Evolution，1997， 7（1）: 62-70.

［16］ Ren N， Timko M P. AFLP analysis of genetic polymorphism and evolutionary relationships among cultivated and wild Nicotiana species［J］. Genome， 2001，44（4）: 559-571.

［17］ 劉勝傳，劉仁祥，雷紅梅，等. 利用SSR標記分析部分煙草種質(zhì)的遺傳多樣性［J］. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37 （7）：1-3.

［18］ 李文平. 煙草種質(zhì)遺傳多樣性的 SSR標記分析及抗TMV鑒定［D］. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010：20-23.

［19］ 肖炳光，盧江平，盧秀萍，等. 烤煙品種的RAPD分析［J］. 中國煙草學(xué)報，2000，6（2）：10-15.

［20］ 何川生，何興金，葛頌，等. 烤煙品種資源的RAPD分析［J］. 植物學(xué)報，2001，43（6）：610-614.

［21］ 何其芳. 94份煙草材料的遺傳多樣性和主要品質(zhì)成分的分析［D］. 廣州：華南理工大學(xué)，2012：40-45.

Analysis of Genetic Diversity and Population Structure of Germplasm Resources in Nicotiana tabacum

ZHANG Mingzhen， XING Xuexia， LI Xiaohui， YANG Tiezhao， XU Shixiao*
（College of Tobacco Science， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

The population structure and genetic diversity of tobacco provide a theoretical basis for identifying elite genes and improving varieties by breeders. Genetic diversity and population structure of 87 tobacco materials were evaluated using 41 polymorphic SSR markers screened from a total of 80 SSR primer pairs. The amplified fragment length polymorphism was detected by The Applied Biosystems 3500 xl Genetic Analyzer. The results revealed that a sum of 241 polymorphism sites were found using the 41 SSR primer pairs， with an average of 5.88 sites per primer pair. The genetic similarity coefficient ranged from 0.47-0.91， and the PIC averaged 0.63， ranging from 0.23-0.91. Results from the clustering analysis based on a model-based method indicated that when K=2， the largest delta K value， namely 87 tobacco materials can be divided into two groups （P1 and P2， with the P1 group further divided into five classes and the P2 group further divided into two classes. The genetic diversity of tobacco germplasm was abundant and the division of population structure was not completely related to germplasm type.

tobacco； SSR fluorescent markers； genetic diversity； population structure

S572.03

1007-5119（2016）04-0042-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.04.008

中國煙草總公司重大項目“高抗根結(jié)線蟲病優(yōu)質(zhì)烤煙新品種選育”（110201402004）

張銘真（1992-），女，碩士研究生，研究方向為煙草遺傳育種與生理。E-mail：yczhangmingzhen@163.com*通信作者，E-mail：xushixiao@126.com

2016-01-25

2016-03-05