劉玉穎　楊文濤　楊桂連　王春鳳

(吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，長春130118)

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CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建小鼠癌癥模型的初步研究進展①

劉玉穎楊文濤楊桂連王春鳳

(吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，長春130118)

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)首次在K12大腸桿菌的堿性磷酸酶基因位點附近發(fā)現(xiàn)，后統(tǒng)一稱為規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列，是在大多數(shù)細菌、古細菌中廣泛存在的一類獨特的DNA規(guī)律性重復(fù)序列[1]。Cas(CRISPR-associated)基因是位于CRISPR區(qū)域臨近處的蛋白質(zhì)編碼基因,而且相對保守。Cas基因可與CRISPR轉(zhuǎn)錄出的RNA結(jié)合并形成核糖核蛋白復(fù)合物，在原核生物中發(fā)揮獲得性免疫功能，使宿主獲得抵抗噬菌體、質(zhì)粒等外來DNA入侵的免疫能力。CRISPR/Cas技術(shù)是由RNA指導(dǎo)Cas核酸酶對靶向DNA進行特定修飾，能夠共定位RNA、DNA和蛋白，因而擁有巨大的改造潛力。此外，也在研究人類疾病致病機理和治療手段中起到了關(guān)鍵作用。最近，有研究對21種癌癥類型開展大規(guī)模分析，并將與癌癥有關(guān)的已知基因目錄擴增了25%[2]，還有許多重要的癌基因有待進一步發(fā)現(xiàn)。而癌癥小鼠模型可對癌基因組進行深入研究，因此，CRISPR/Cas9以其高效、準確的對特定基因進行敲除或修飾，已成為目前最具有臨床與應(yīng)用前景的基因編輯技術(shù)之一。

1　CRISPR/Cas9技術(shù)的主要原理

CRISPR/Cas9是RNA引導(dǎo)的DNA內(nèi)切酶系統(tǒng)，Cas9內(nèi)切酶形成兩種復(fù)雜的天然RNA物種，分別為crRNA(CRISPR-derived RNA)和tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)[3]。crRNA通過堿基配對與tracrRNA(trans-activating RNA)結(jié)合，形成雙鏈RNA。指導(dǎo)Cas9蛋白在crRNA引導(dǎo)序列靶標的特定位點產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(DSBs)，由此實現(xiàn)對基因組DNA序列進行編輯。簡言之，crRNA與tracrRNA可通過任意一個莖環(huán)序列連接產(chǎn)生一種合成單導(dǎo)向RNA(sgRNA)。其他確定靶序列特異性的關(guān)鍵因素是前間區(qū)序列鄰近基序(PAM)，PAM緊鄰基因組位點的靶位點，但并非是sgRNA序列的一部分。CRISPR/cas9產(chǎn)生的DNA雙鏈斷裂是通過非同源末端連接(NHEJ)或同源性指導(dǎo)修復(fù)(HDR)途徑修復(fù)，導(dǎo)致不同的DNA序列突變。與傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)相比[4]，采用核酸酶的方法，如鋅指核酸酶(ZFN)，轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas，具有通過直接在受精卵修改染色體而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物的優(yōu)勢，減少對雄性生殖能力的胚胎干細胞系的需要，為創(chuàng)造突變體動物節(jié)省成本、縮短時間[5,6]。尤其新近開發(fā)的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是繼ZFN和TALEN技術(shù)之后迅速發(fā)展起來的最新的基因組編輯技術(shù)，且與ZFN或TALEN等其他基因組編輯技術(shù)相比具有更顯著的優(yōu)點。與ZFN和TALEN在千百個堿基中篩選一個可用位點相比CRISPR/Cas9在基因組中每8個堿基就能找到一個可進行編輯的位置，擴大了使用范圍。因此CRISPR/Cas9似乎有取代ZNFs與TALENs成為多數(shù)實驗室首選基因編輯技術(shù)的趨勢。這些新的基因編輯技術(shù)，使在不同物種的細胞系中產(chǎn)生靶基因突變和敲除成為可能，甚至整個生物體都可以不通過降解mRNA產(chǎn)物直接發(fā)生基因組突變。從而提高了基因組編輯的效率。

2　CRISPR-Cas9技術(shù)在構(gòu)建小鼠癌癥模型中的應(yīng)用現(xiàn)狀

傳統(tǒng)的癌癥小鼠模型主要依賴于轉(zhuǎn)基因或同源重組的胚胎干細胞。在野生型囊胚注射轉(zhuǎn)基因ES細胞，產(chǎn)生生殖系嵌合體改變，由此產(chǎn)生單基因敲除小鼠或雙突變小鼠，但該方法昂貴、費時。此外，由于其他哺乳動物物種沒有建立ES細胞系，因此該方法限制了對其他許多物種的研究[7]。要研究癌基因與抑癌基因，需要精確修飾基因組，以產(chǎn)生可供仔細檢測的突變。這對美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)的癌癥基因組圖譜(TCGA)驗證大量候選癌基因極為重要。TCGA旨在全面的描述突變和癌癥基因組特征。因為癌癥突變的子集可能與癌癥演變是不相關(guān)的(所謂的“乘客基因”)，它對確定那些與癌癥演變有關(guān)的候選基因(癌癥驅(qū)動基因)進行功能驗證是極其重要的。面對這樣龐大、復(fù)雜的基因組，需要有一個簡單、靈活的技術(shù)手段，構(gòu)建一種具備在眾多乘客基因突變點中識別功能癌癥驅(qū)動基因突變的小鼠模型。

2.1基于不同遞送載體的CRISPR-Cas9技術(shù)最近，癌癥基因組項目已經(jīng)確定了大量與癌癥有關(guān)的基因組的改變，如缺失、易位、倒置[2]。然而，由于利用Cre-LoxP方法創(chuàng)建大型結(jié)構(gòu)變化相當耗時，因而許多與癌癥相關(guān)的結(jié)構(gòu)變化的功能尚不清楚。雖然，小鼠模型的構(gòu)建操作相對簡單可行，對人類遺傳性疾病的藥物篩選和基因治療具有指導(dǎo)意義。但是，要在小鼠模型中充分探討癌癥，尋找超越實體腫瘤的模型是極具挑戰(zhàn)的。與此同時，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在小鼠癌癥模型中也取得了突破性進展。例如，編碼Cas9和sgRNAs的DNA質(zhì)粒被單獨或以復(fù)合物的形式傳遞到肝靶向腫瘤抑制基因p10和p53[10]，為肝癌研究奠定基礎(chǔ)。有趣的是，基于腺伴隨病毒(Adeno associated virus，AAV)的Cas9/sgRNA遞送載體，以其非致病性、高效和簡單的構(gòu)建特點，已被用于靶向成年小鼠神經(jīng)元的有絲分裂后期，旨在闡明影響認知及行為的復(fù)雜疾病遺傳學。此外，這種Cas9/sgRNA遞送載體技術(shù)也通過多重破壞候選基因為模擬腦癌提供了潛在的適用方法[11]。目前，已有用Cre-dependent Cas9技術(shù)建造基因敲入小鼠且用于對體內(nèi)及體外的基因組編輯。使用這種方法，用單一AAV載體在肺中產(chǎn)生p53基因功能缺失突變、Lkb1基因突變以及HDR介導(dǎo)的KrasG12D突變，由此對肺腺癌的病理學進行模擬[12]。還有研究通過一個MuLE慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)原代培養(yǎng)的小鼠細胞，設(shè)計包含不同基因改變的腫瘤，同時誘導(dǎo)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的抑癌基因敲除，并表明單獨使用該方法或與生殖細胞遺傳學方法相結(jié)合，可為培養(yǎng)哺乳動物細胞及建造小鼠模型提供新的實驗遺傳力[13]。

2.2CRISPR-Cas9技術(shù)篩選小鼠腫瘤功能失活基因遺傳篩選是用于鑒定不同表型的基因的有力工具。現(xiàn)已有研究，用CRISPR/Cas9技術(shù)在一個全基因組范圍內(nèi)對腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的功能失活基因進行篩選[14]。 通過sgRNAs誘變處理一個非轉(zhuǎn)移性小鼠癌細胞，并將其移植到免疫功能低下小鼠中，會發(fā)生突變細胞池迅速產(chǎn)生轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。且在肺轉(zhuǎn)移性腫瘤及晚期原發(fā)性腫瘤中發(fā)現(xiàn)富集的sgRNAs可靶向一小部分基因，該發(fā)現(xiàn)表明特定的功能缺失突變可促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。而且突變對原發(fā)性腫瘤生長的影響與轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)。因此，在對體內(nèi)癌癥演變的基因表型系統(tǒng)分析方面，Cas9技術(shù)篩選是一種相對穩(wěn)健的方法。

2.3CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)EML4-ALK肺癌小鼠模型人類癌癥的基因工程小鼠模型對剖析腫瘤發(fā)生的潛在分子機制必不可少，并為研究癌癥藥物的敏感性及耐藥性提供強大的基礎(chǔ)平臺。CRISPR技術(shù)具有優(yōu)于胚胎工程的轉(zhuǎn)基因或同源重組技術(shù)的一些優(yōu)點。它可通過對體細胞的一個子集誘導(dǎo)重排，由此產(chǎn)生的病變能更緊密的概括人類腫瘤形成的隨機性。而且，染色體重排已被證明是引起人類幾種類型癌癥的主要原因[15]。 最近的研究報告表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)在體外高頻率誘導(dǎo)人類細胞系中靶向癌癥相關(guān)的染色體重排方面極具應(yīng)用潛力[16]。以EML4-ALK重排為例，有研究在人類非小細胞肺癌(NSCLC)的一個子集中檢測到EML4-ALK致癌基因，且因這種基因?qū)LK抑制劑敏感而與臨床相關(guān)，于是使用病毒介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)對成年動物的體細胞誘導(dǎo)特異性染色體重排，運用它來生成一個EML4-ALK肺癌小鼠模型[17]，此技術(shù)極大地擴展了我們用小鼠模擬人類及其他生物癌癥的潛力。此外，用EML4-ALK驅(qū)動的新型肺癌小鼠模型驗證了CRISPR技術(shù)可以適用于小鼠致癌基因工程染色體重排。并為深入研究通過EML4-ALK驅(qū)使腫瘤形成的分子機制、檢測靶向藥物治療療效及探討體內(nèi)耐藥機制提供了極難得的機會。更顯著地是，該方法只需要一個適當?shù)牟《据d體和無胚胎操作生成，可以很容易地適應(yīng)在其他物種的染色體重排模型，包括非人類的靈長類動物，從而促進對腫瘤及體內(nèi)治療反應(yīng)的種特異性差異的研究。

2.4CRISPR/Cas9技術(shù)的其他成果在過去的幾個月里，已有科研小組證實CRISPR/Cas9技術(shù)對建造大型染色體改變及體外模型極具潛力。國內(nèi)已有報道，南京大學的研究團隊首先利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了1只定向敲除單拷貝外源基因嵌合鼠[8]，以此證明CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在制作基因打靶小鼠中的可行性及Cas9蛋白在小鼠胚胎中的活性。而美國科學家用向小鼠的合子注射CRISPR和Cas9的RNA技術(shù)，成功構(gòu)建了多基因敲除小鼠，以同樣的方式注入到胚胎干細胞，取得了同時敲除5個內(nèi)源基因，效率高達10%的成果[9]。

CRISPR已被用于產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)基因小鼠模型，基因敲除/敲入生殖細胞模型、體細胞基因組編輯模型、小鼠藥物治療模型等。CRISPR已被證明是染色體工程研究的一種實用工具，通過基因組編輯生成體外白血病細胞株模型并識別耐藥基因。CRISPR也被用來通過同源性修復(fù)途徑，修正疾病相關(guān)基因。與傳統(tǒng)的Cre-LoxP方法相比，CRISPR能夠產(chǎn)生限定的基因敲除、基因敲入小鼠模型，可更進一步探索癌癥演變。

3　CRISPR/Cas9技術(shù)的潛在問題

近兩年中，CRISPR-Cas9技術(shù)與癌癥模型產(chǎn)生是科研領(lǐng)域的極大進步，盡管CRISPR/Cas9技術(shù)在介導(dǎo)基因失活方面提供優(yōu)勢，但在實驗設(shè)置中也存在技術(shù)上的障礙。目前面臨的主要障礙包括Cas9基因組編輯工具仍然需要后續(xù)的表型或基因篩選，通常需要選擇比較少見的修飾細胞[18]；建立體細胞小鼠模型并在體內(nèi)使用CRISPR/Cas9技術(shù)糾正致病基因的突變；改進CRISPR傳遞(蛋白或mRNA)、分裂Cas9以提高體內(nèi)基因組編輯效率[19,20]；查找小尺寸Cas9蛋白替代物促進CRISPR病毒載體包裝[21]。此外，雖已有報道表明CRISPR/Cas9在基因編輯上極具前景，但其安全性仍備受關(guān)注。精密小鼠模型要求最小限度的脫靶效應(yīng)。于是，未來研究需側(cè)重仔細評價CRISPR/Cas9的安全性。已有研究組開發(fā)出減少脫靶的基因組編輯技術(shù)，比如cas9 D10A核酸內(nèi)切酶型sgRNA、偏移型sgRNA、頓挫型sgRNA和dcas9-FokI融合蛋白[22-25]。Cas9脫靶位點的全基因組分析已有報道[26]，監(jiān)測脫靶效應(yīng)將是發(fā)展此項技術(shù)極其重要的一步。

4　結(jié)語

隨著大規(guī)模人類腫瘤基因組測序成功，如TCGA，使最終鑒定新的、明確的抑癌基因或癌基因的功能性研究變得迫在眉睫。CRISPR系統(tǒng)為建立腫瘤模型、探討藥物治療及識別各種新的藥物靶基因和抗性基因提供了一種快速、簡便可靠的方法，癌癥涉及抑癌基因與癌基因復(fù)雜的變化及突變，CRISPR系統(tǒng)用于建立與探討腫瘤模型頗具前途。多種技術(shù)均使用CRISPR系統(tǒng)用于生殖細胞與體細胞基因組編輯的基因敲除、敲入、染色體重排模型，成功創(chuàng)造了基因敲除/敲入小鼠模型、實體瘤模型、白血病小鼠模型等不同的小鼠腫瘤模型。CRISPR與傳統(tǒng)Cre-loxP方法相結(jié)合表明，建立精密小鼠模型以便深入了解腫瘤抑癌基因與癌基因協(xié)同作用這一努力方向極具希望。CRISPR也適合全基因組篩選確定耐藥基因。CRISPR介導(dǎo)的基因組編碼及基因篩選將促進癌癥基因組學及功能研究。

在未來，CRISPR/Cas9系統(tǒng)將會更精細化調(diào)整，加速在體外、體內(nèi)的基因組編輯以建立新的癌癥模型以便深入了解復(fù)雜的抑癌基因與癌基因之間的互作效應(yīng)。此外，以光誘導(dǎo)的dcas9為代表的新型Cas9融合蛋白具有新的特性，可賦予CRISPR額外的優(yōu)勢。用對體內(nèi)RNA干擾相類似的方式，體內(nèi)CRISPR篩選可鑒別新的癌癥驅(qū)動基因[27]。除了優(yōu)化CRISPR方法，我們還應(yīng)拓寬CRISPR在基因治療中的應(yīng)用，從單基因突變到多基因修飾來精確編輯基因組，以期最終防治癌癥、糖尿病等復(fù)雜的遺傳性疾病。這種新技術(shù)將會繼續(xù)變革現(xiàn)代生物學。此外，預(yù)想利用基因組編輯的方法構(gòu)建更精細化的癌癥小鼠模型，以了解個別癌癥及確定治療手段。優(yōu)化癌癥小鼠模型將為癌癥的精確治療鋪平道路。

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[收稿2015-07-21修回2015-08-12]

(編輯許四平)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.032

劉玉穎(1988年-)，女，在讀碩士，主要從事動物微生態(tài)與黏膜免疫的研究。

及指導(dǎo)教師：楊桂連(1978年-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事動物寄生蟲免疫學研究，E-mail：yangguilian@jlau.edu.cn。

王春鳳(1972年-)，女，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事動物微生態(tài)與黏膜免疫的研究，E-mail：wangchunfeng@jlau.edu.cn。

Q789

A

1000-484X(2016)09-1384-04

①本文受國家“863”計劃項目(2013AA102806，2011AA10A215)、國家自然科學基金項目(31272552，31272541，81170358)、教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃項目(NCET-10-0175)、吉林省科技發(fā)展計劃項目(20111816)和吉林省世行貸款農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全項目(2011-Y07)資助。