王莉莉，楊　超，董全江，孫桂榮

(1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東青島 266003；2.青島市市立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266011)

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青島地區(qū)幽門(mén)螺桿菌多重耐藥現(xiàn)狀和突變特征分析

王莉莉1,2，楊超2，董全江2，孫桂榮1△

(1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東青島 266003；2.青島市市立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266011)

摘要:目的分析青島地區(qū)幽門(mén)螺桿菌(Hp)對(duì)常用抗菌藥物的單一耐藥和多重耐藥情況，并探討相關(guān)耐藥基因突變的特征。方法從胃竇黏膜標(biāo)本分離培養(yǎng)Hp，應(yīng)用瓊脂稀釋法藥敏試驗(yàn)分別檢測(cè)Hp對(duì)克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑的敏感性；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法擴(kuò)增Hp克拉霉素耐藥基因23S rRNA、左氧氟沙星耐藥基因gyrA和甲硝唑耐藥基因rdxA；PCR產(chǎn)物測(cè)序后應(yīng)用ClustalW2軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析。結(jié)果藥敏檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，臨床分離的134株Hp菌株對(duì)克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑3種抗菌藥物單一耐藥率分別為40.3%、34.3%和43.3%；僅17.9% Hp對(duì)3種抗菌藥物均敏感；多重耐藥率為29.9%，三重耐藥率為9.0%；左氧氟沙星+甲硝唑雙重耐藥率(3.0%)低于克拉霉素+左氧氟沙星(10.4%)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 5.96，P=0.015)。耐藥基因序列分析表明青島地區(qū)23S rRNA 最常見(jiàn)突變位點(diǎn)為A2143G(77.8%)，gyrA基因突變最常見(jiàn)的突變方式為N87K(78.3%)，rdxA基因最常見(jiàn)的突變方式為第20、32位點(diǎn)核苷酸插入A，產(chǎn)生移碼突變，突變率為44.8%。結(jié)論青島地區(qū)Hp多重耐藥率高，應(yīng)根據(jù)藥敏檢測(cè)結(jié)果選擇有效抗菌藥物。左氧氟沙星可作為本地區(qū)根除治療方案的一線用藥。

關(guān)鍵詞:幽門(mén)螺桿菌；克拉霉素；左氧氟沙星；甲硝唑；耐藥

幽門(mén)螺桿菌(Hp)是一種革蘭陰性、微需氧的螺旋狀桿菌，是引起慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍、胃癌及MALT淋巴瘤的主要致病菌[1]。細(xì)菌耐藥是引起Hp根除治療失敗的主要原因，而多重抗菌藥物耐藥會(huì)顯著降低Hp根除率。研究發(fā)現(xiàn)，Hp耐藥性有明顯的地區(qū)差異[2-3]，經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見(jiàn)青島地區(qū)Hp多重耐藥的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)分析青島地區(qū)Hp對(duì)常用抗菌藥物的單一耐藥和多重耐藥情況，并探討相關(guān)的耐藥基因突變特征，旨在為本地區(qū)臨床提高Hp根除效率提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2011~2014年在青島市市立醫(yī)院經(jīng)胃鏡和病理檢查確診的慢性胃炎患者168例，男 95例，女73例，年齡30～72歲，平均(45.7±6.3)歲；胃癌患者90例，男53例，女37例，年齡41～79歲，平均(55.5±12.1)歲，所有患者均未接受過(guò)根除Hp治療。胃竇黏膜標(biāo)本經(jīng)快速尿素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)Hp陽(yáng)性。胃竇黏膜組織置于1 mL腦心浸出液(BHI)液體培養(yǎng)基中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩１狙芯糠桨竿ㄟ^(guò)本院倫理委員會(huì)審核，納入研究前所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2儀器與試劑細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和2×Taq PCRMasterMix購(gòu)自天根生化科技有限公司；BHI培養(yǎng)基、Hp選擇性添加劑、細(xì)菌培養(yǎng)罐和微需氧產(chǎn)氣袋均購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；革蘭染液購(gòu)自濟(jì)南百博生物技術(shù)有限公司；恒溫箱購(gòu)自美國(guó)Themo公司；普通PCR儀購(gòu)自美國(guó)Labnet公司；凝膠分析儀購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司；Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11637來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定胃黏膜活檢標(biāo)本接種于5%去纖維馬血BHI瓊脂固體培養(yǎng)基(含Hp選擇性添加劑)表面接種劃痕，置于37 ℃微需氧環(huán)境中(5% O2，10% CO2，85% N2)培養(yǎng)5～7 d。挑取透明樣針尖大小菌落進(jìn)行尿素酶、過(guò)氧化氫酶、氧化酶及革蘭染色鑒定Hp并傳代，2 d后收集細(xì)菌置于磷酸鹽緩沖液(PBS)液中，-80 ℃保存，用于提取Hp基因組DNA。

1.3.2瓊脂稀釋法藥敏試驗(yàn)分別制備含不同濃度抗菌藥物(克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑)的平板,各在其上劃6個(gè)扇區(qū),每個(gè)扇區(qū)接種1株細(xì)菌(108cfu/ mL)。同時(shí)各菌株平行接種于無(wú)抗菌藥物的平板為對(duì)照。置37 ℃、微需氧條件下培養(yǎng)3 d觀察結(jié)果。以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的抗菌藥物最高稀釋度作為最低抑菌濃度(MIC)。根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)指南[4]，克拉霉素MIC≥1 μg/mL，左氧氟沙星MIC≥1 μg/mL，甲硝唑MIC≥8 μg/mL 定為耐藥菌株。藥敏質(zhì)控采用Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11637與試驗(yàn)同步進(jìn)行。

1.3.3PCR擴(kuò)增采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒按照說(shuō)明書(shū)步驟提取Hp基因組DNA。分別擴(kuò)增Hp克拉霉素耐藥基因23S rRNA、左氧氟沙星耐藥基因gyrA 和甲硝唑耐藥基因rdxA。擴(kuò)增引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成，序列詳見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系為：引物各5 μmoL，模板DNA 20 ng，2×Taq Mix 12.5 μL，補(bǔ)雙蒸水(ddH2O)至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min、52 ℃ 30 s(rdxA為50 ℃)、72 ℃ 1 min循環(huán)30 次，72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的基因長(zhǎng)度和完整性，見(jiàn)表1。

表1　　PCR擴(kuò)增引物序列表

1.3.4基因測(cè)序及結(jié)果分析PCR產(chǎn)物切膠純化后采用Sanger測(cè)序法進(jìn)行基因測(cè)序(AB 3730XL測(cè)序儀，美國(guó))，由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。采用MEGA5.1分子生物學(xué)軟件分析耐藥基因的核苷酸和氨基酸序列,并與Hp敏感株26695 基因序列(GeneBank CP003904.1)進(jìn)行ClustalW2 比對(duì)，分析突變方式和突變位點(diǎn)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，選擇χ2檢驗(yàn)對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Hp單一耐藥分析Hp陽(yáng)性的活檢標(biāo)本共分離出134株Hp。瓊脂稀釋法藥敏檢測(cè)發(fā)現(xiàn)僅17.9%(24株)Hp菌株對(duì)克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑3種抗菌藥物均敏感，見(jiàn)表2，臨床分離的Hp菌株對(duì)克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑3種抗菌藥物單重耐藥率分別為40.3%、34.3%和43.3%，雖然左氧氟沙星耐藥率低于克拉霉素和甲硝唑，但3種抗菌藥物之間耐藥差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2Hp多重耐藥分析134株Hp中，有29.9%(40株)同時(shí)對(duì)兩種或兩種以上抗菌藥物耐藥。由表2可見(jiàn)，雙重耐藥的Hp菌株中，克拉霉素+左氧氟沙星耐藥率為10.4%(14/134)，而左氧氟沙星+甲硝唑耐藥率最低，為3.0%(4/134)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 5.96，P=0.015)。這提示青島地區(qū)Hp臨床分離株對(duì)左氧氟沙星+甲硝唑聯(lián)合用藥比克拉霉素+左氧氟沙星更敏感。Hp臨床分離株三重抗菌藥物耐藥比例為9.0%(12/134)，提示多重耐藥菌株將嚴(yán)重影響臨床根除Hp治療的效果，見(jiàn)表2。

表2　　Hp對(duì)3種抗菌藥物耐藥分析

2.3Hp耐藥基因突變特征分析Hp克拉霉素耐藥相關(guān)基因23S rRNA、左氧氟沙星耐藥相關(guān)基因gyrA和甲硝唑耐藥相關(guān)基因rdxA分別經(jīng)PCR法擴(kuò)增全長(zhǎng)序列，PCR產(chǎn)物直接測(cè)序。從GenBank中調(diào)取Hp26695的相對(duì)應(yīng)序列，應(yīng)用Clustal W2程序比對(duì)所有耐藥基因序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)54株克拉霉素耐藥Hp菌株的23S rRNA V區(qū)均有基因突變發(fā)生，突變位點(diǎn)A2143G最常見(jiàn)，突變率為77.8%，其他突變方式為A2174G(5.6%)、A2187G(3.7%)、A2223G(7.3%)等，見(jiàn)表3(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。(2)46株左氧氟沙星耐藥Hp菌株的gyrA基因突變最常見(jiàn)的突變方式為N87K(78.3%)，其次依次為D91Y(10.9%)、A88V(6.5%)等。(3)58株甲硝唑耐藥Hp菌株的rdxA基因突變以插入和缺失單核苷酸為主，最常見(jiàn)的突變方式為第20、32位點(diǎn)核苷酸插入A，產(chǎn)生移碼突變，導(dǎo)致第23氨基酸(aa)序列出現(xiàn)終止密碼子引起蛋白功能失活，突變率為44.8%。其他移碼突變發(fā)生位點(diǎn)散布于全基因序列。

3討論

目前國(guó)內(nèi)推薦用于Hp根除治療的抗菌藥物包括：克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林、呋喃唑酮和四環(huán)素[5]。本研究針對(duì)最常用的抗菌藥物包括克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑進(jìn)行藥敏檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青島地區(qū)僅17.9%的 Hp菌株對(duì)上述3種抗菌藥物均敏感，而多重耐藥菌株達(dá)29.9%，其中三重耐藥菌株達(dá)9.0%。這些結(jié)果提示無(wú)藥敏檢測(cè)指導(dǎo)的隨機(jī)選取抗菌藥物治療Hp感染的有效率會(huì)顯著下降。不同地區(qū)Hp多重耐藥率有所差異，浙江地區(qū)為23.6%[6]，上海地區(qū)高達(dá)37.8%[7]，可能與經(jīng)濟(jì)水平、地理分布、時(shí)間跨度及當(dāng)?shù)蒯t(yī)生的用藥習(xí)慣有一定的相關(guān)性。依據(jù)Maastricht-Ⅳ共識(shí)，基于藥敏試驗(yàn)結(jié)果選用抗菌藥物用于根除療法僅為三線方案[8]。由于本地區(qū)多重耐藥率高達(dá)近1/3而敏感菌株僅不到1/5，因此無(wú)藥敏檢測(cè)指導(dǎo)的一、二線治療方案的效果肯定將會(huì)顯著下降。據(jù)此本研究認(rèn)為在多重耐藥率高的地區(qū)，應(yīng)在藥敏檢測(cè)指導(dǎo)下選擇有效抗菌藥物進(jìn)行根除治療方案，韓國(guó)的一項(xiàng)研究也支持本觀點(diǎn)[9]。無(wú)藥敏檢測(cè)指導(dǎo)的三聯(lián)或者四聯(lián)方案不但有效率低，而且可能進(jìn)一步導(dǎo)致抗菌藥物耐藥的發(fā)生。

本研究臨床分離的Hp菌株雙重耐藥率由低到高依次為：左氧氟沙星+甲硝唑耐藥率(3.0%)、克拉霉素+甲硝唑(7.5%)和克拉霉素+左氧氟沙星(10.4%)。Maastricht-Ⅳ共識(shí)推薦在克拉霉素高耐藥(15%～20%)的地區(qū)，一線方案為鉍劑四聯(lián)療法，二線方案為左氧氟沙星三聯(lián)療法。本地區(qū)臨床分離的Hp菌株對(duì)克拉霉素耐藥率為41.8%，含克拉霉素雙重耐藥率為18%，屬于克拉霉素耐藥高的地區(qū)，因此基于克拉霉素的標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)方案不應(yīng)為本地區(qū)的一線治療方案。本地區(qū)Hp對(duì)左氧氟沙星耐藥率低于克拉霉素和甲硝唑，尤其左氧氟沙星+甲硝唑雙重耐藥率也比較低。桂西地區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)左氧氟沙星+甲硝唑雙重耐藥率僅1.7%，也支持這一結(jié)果[10]。因此本地區(qū)可選擇含左氧氟沙星的Hp根除治療為一線方案。

前期研究表明23S rRNA V區(qū)基因點(diǎn)突變導(dǎo)致Hp對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物耐藥，常見(jiàn)突變位點(diǎn)為2142和2143[11]。 本研究發(fā)現(xiàn)A2143G突變率為77.8%，其他突變方式為A2174G(5.6%)、A2187G(3.7%)、A2223G(7.3%)等，未見(jiàn)2142位點(diǎn)突變，提示青島地區(qū)23S rRNA基因 A2143G為克拉霉素耐藥的主導(dǎo)因素。編碼DNA螺旋酶亞單位gyrA基因的喹諾酮類(lèi)耐藥決定區(qū)(QRDR)基因突變可導(dǎo)致Hp對(duì)左氧氟沙星耐藥，常見(jiàn)耐藥位點(diǎn)為86～88、91[12]。本研究發(fā)現(xiàn)gyrA基因突變最常見(jiàn)的突變方式為N87K，與之前報(bào)道一致[13]。rdxA基因突變引起的酶活性喪失是Hp對(duì)甲硝唑耐藥的主要因素[14]。本研究發(fā)現(xiàn)耐甲硝唑Hp菌株的rdxA基因第20、32位點(diǎn)核苷酸插入A產(chǎn)生移碼突變，突變率為44.8%，為本地區(qū)Hp對(duì)甲硝唑耐藥的主導(dǎo)因素。

綜上所述，青島地區(qū)Hp多重耐藥率高，應(yīng)根據(jù)藥敏檢測(cè)結(jié)果選擇有效抗菌藥物。左氧氟沙星可作為本地區(qū)根除治療方案的一線用藥，其臨床療效有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

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·論著·

Prevalence and genetic features of multi-drug resistant Helicobacter pylori strains from Qingdao

WangLili1,2,YangChao2,DongQuanjiang2,SunGuirong1△

(1.ClinicalLaboratory,AffiliatedHosptialofQingdaoUniversity,Qingdao,Shandong266003,China;

2.CentralLaboratory,QingdaoMunicipalHospital,Qingdao,Shandong266011,China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the single resistance and multiple resistance situation of of Helicobacter pylori (Hp) in Qingdao area to commonly used antibacterial drugs and to investigate the mutation characteristics of drug-related resistant genes.Methods Hp was isolated from the mucosal samples of gastric antrum.The agar diffusion test was used to determine the susceptibility of Hp to clarithromycin,levofloxacin and metronidazole.The 23s rRNA of clarithromycin resistance gene,gyrA of levofloxacin resistance gene and rdxA of metronidazole resistance gene were amplified by using PCR,after the PCR products sequencing,the sequence comparative analysis was performed by the ClustalW2 software.ResultsThe drug susceptibility test results found that the single resistance rates of 134 strains of clinically isolated Hp to clarithromycin,levofloxacin and metronidazole were 40.3%,34.3% and 43.3%,respectively.Only 17.9% of Hp strains were susceptible to these 3 kinds of antibacterial drug;the multi-drug resistance rate was 29.9%,triple drug resistance rate was 9.0%;furthermore,the double resistance rate of levofloxacin plus metronidazole was significantly lower than that of clarithromycin plus levofloxacin,the difference was statistically significant(3.0% vs. 10.4%,χ2= 5.96，P=0.015).The drug resistance genes sequence analyses showed that the commonest mutation locus was A2143G (77.8%),the commonest mode of gyrA gene mutation was N87K(78.3%),and which of rdxA gene was nucleotide insertion into loci 20/32,generating the frameshift mutation with the mutation rate of 44.8%.ConclusionThe multi-drug resistance rate of Hp is high in Qingdao area.The effective antibacterial drugs should be selected according to the drug susceptibility test results.Levofloxacin could serve as the first line drug for the eradication therapy scheme in this area.

Key words:Helicobacter pylori;clarithromycin;levofloxacin;metronidazole;resistance

收稿日期：(2015-08-16)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.032A

文章編號(hào)：1673-4130(2015)24-3583-03