孟令旗，劉 暢，孫虎男，羅英花，臧延青，韓英浩，金成浩

(黑龍江八一農墾大學 1.生命科學技術學院、2.動物科學技術學院、3.食品科學技術學院，黑龍江 大慶 163319)

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醌茜素對人肺癌A549細胞增殖、凋亡的影響及初步機制研究

孟令旗1，劉 暢1，孫虎男1，羅英花2，臧延青3，韓英浩1，金成浩1

(黑龍江八一農墾大學 1.生命科學技術學院、2.動物科學技術學院、3.食品科學技術學院，黑龍江 大慶 163319)

醌茜素是一種具有高效性、高選擇性和細胞能透性的藥物。雖然醌茜素能夠有效抑制前列腺癌細胞的增殖[1]，但醌茜素對肺癌細胞的作用機制尚不清楚。本文研究了醌茜素對人肺癌A549細胞周期及細胞凋亡的影響，并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 3種人肺癌A549、NCI-H23、NCI-H460細胞株及正常肝QSG-7701細胞株(上海中科院細胞庫)；醌茜素(上海綠鳥科技發(fā)展有限公司)；5-Fluorouracil(上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司)；RPMI 1640(美國Hyclone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；MTT(美國Amresco公司)；DMSO(美國Sigma公司)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)；HRP標記山羊抗兔、抗鼠IgG(美國Santa Cruz公司)；ECL化學發(fā)光試劑(美國Thermo公司)；CO2培養(yǎng)箱(日本SanYo公司)；FACSCalibvr型流式細胞儀(美國BD公司)；電泳儀、半干轉印儀(美國Bio-rad公司)；MicroChemi4.0型化學發(fā)光型凝膠成像系統(tǒng)(DNR公司)。

1.2 方法 采用MTT比色法檢測3種人肺癌A549、NCI-H23、NCI-H460及正常肝QSG-7701細胞的存活率，對照藥物為5-FU。采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測醌茜素處理A549細胞后凋亡情況。通過流式細胞術檢測細胞周期阻滯情況和細胞凋亡數(shù)量的變化。通過蛋白質免疫印跡法檢測細胞周期相關蛋白表達量變化及細胞凋亡相關信號通路。

2 結果

2.1 醌茜素對人肺癌細胞存活率的影響 結果顯示，不同濃度(0、1、3、10、30、100 μmol·L-1)的醌茜素均對人肺癌(A549、NCI-H460及NCI-H23)細胞的生長有抑制作用(P<0.01)，呈劑量依賴性，而且對正常肝QSG-7701細胞無明顯毒性作用，說明醌茜素對3種人肺癌細胞均具有明顯的增殖抑制作用。

2.2 醌茜素對人肺癌A549細胞周期的影響 結果顯示，用9.9 μmol·L-1醌茜素處理細胞0、3、6、12、24 h后，當處理時間為24 h時，使A549細胞阻滯于G0/G1期。隨后，蛋白質免疫印跡法結果顯示，細胞周期G0/G1期相關蛋白CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin D1、Cyclin E的表達量均逐漸減少，與對照組相比差異有顯著性(P<0.01)，說明醌茜素通過調控人肺癌A549細胞周期相關蛋白的表達，誘導A549細胞G0/G1期的阻滯。

2.3 醌茜素對人肺癌A549細胞形態(tài)的影響 結果顯示，對照組(0 h)細胞生長貼壁較牢固，細胞膜邊界完整。隨著處理藥物時間(0、3、6、12、24 h)的延長，細胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，細胞發(fā)生皺縮，變圓，出現(xiàn)類似細胞凋亡的特征。通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著藥物處理時間的延長，Annexin V-FITC和PI的熒光強度逐漸增強，與陽性對照組(5-FU處理組)相比差異有顯著性(P<0.01)。

2.4 醌茜素對人肺癌A549細胞凋亡的影響 通過9.9 μmol·L-1醌茜素處理細胞0、3、6、12、24 h后，流式細胞術結果顯示，死細胞比例未見明顯升高，而細胞早期凋亡及晚期凋亡的百分率隨著處理時間的增加出現(xiàn)明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。隨后，蛋白質免疫印跡法結果顯示，p-Akt、p-p38、Bcl-2、procaspase-9及procaspase-3等蛋白的表達量逐漸減少，p-p53、Bad、cleaved caspase-3及cleaved PARP等蛋白的表達量逐漸增加(P<0.01)，說明醌茜素通過調控Akt、p38及p53信號通路誘導人肺癌A549細胞發(fā)生凋亡。

3 討論

肺癌是預后最差的惡性腫瘤之一[2]。目前，臨床上的抗腫瘤藥物多數(shù)具有價格昂貴、毒副作用強等缺點，因此，尋找高效、低毒的抗腫瘤藥物成為國內外研究的熱點。醌茜素是一類蒽醌類化合物，對多種癌細胞均具有抑制增殖的作用。本實驗通過MTT比色法驗證了醌茜素能夠抑制3種人肺癌細胞增殖[3]；通過流式細胞術和Western blot[4]實驗驗證了醌茜素通過調節(jié)G0/G1期周期蛋白的活性和表達，阻滯細胞周期進程，從而抑制A549細胞的增殖，并能通過Akt、p38及p53蛋白信號通路誘導人肺癌A549細胞的凋亡。

(致謝：本實驗是在分子病理與藥效學實驗室完成，衷心感謝對實驗給予幫助的老師和同學！)

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Effects of quinalizarin on proliferation and apoptosis of human lung cancer A549 cells and its possible mechanism

MENG Ling-qi1,LIU Chang1,SUN Hu-nan1,LUO Ying-hua2,ZANG Yan-qing3,HAN Ying-hao1,JIN Cheng-hao1

(1.CollegeofLifeScience&Technology, 2.CollegeofAnimalScience&VeterinaryMedicine, 3.CollegeofFoodScience&Technology,HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,DaqingHeilongjiang163319,China)

醌茜素；人肺癌A549細胞；細胞增殖；細胞凋亡；細胞周期；信號通路

quinalizarin; human lung cancer A549 cells; cell proliferation; cell apoptosis; cell cycle; signaling pathway

2016-07-24,

2016-08-29

黑龍江省自然基金項目(No LC2015036)；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(No 201510223003)

孟令旗(1993-)，男，碩士生，研究方向：分子病理學與藥效學，E-mail：523336674@qq.com；

金成浩(1977-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：分子病理學與藥效學，通訊作者，Tel:0459-6819301,E-mail: jinchenghao3727@qq.com

時間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.058.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.029

A

1001-1978(2016)11-1625-02

R329.24；R329.25； R734.202.2；R979.1