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骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化中信號轉導途徑與雌激素受體的關系

林思文1王麗麗2施劍明1殷明

(南昌大學第二附屬醫(yī)院骨一科，江西南昌330006)

〔關鍵詞〕成骨分化;雌激素受體;信號通路

婦女在絕經(jīng)后由于體內(nèi)雌激素生成及分泌減少，骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)成骨分化能力減弱，導致成骨細胞生成減少，骨骼不能對適度負荷產(chǎn)生足夠的適應性骨重建，容易引起骨質(zhì)疏松，甚至發(fā)生骨折。雌激素可以通過直接調(diào)節(jié)、旁分泌和細胞凋亡等機制作用于成骨細胞和破骨細胞而發(fā)揮作用，促進成骨細胞及抑制破骨細胞增殖，影響骨代謝，防治骨質(zhì)疏松〔1〕。對于預防及治療絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松，保持體內(nèi)雌激素水平尤為重要〔2〕。

所有關系到骨形成和骨吸收的細胞均表達雌激素受體(ERs)〔3〕。ER具有6個結構區(qū)：A區(qū)和B區(qū)共同構成激活功能域(AF)-1；C區(qū)為位于C-末端的DNA結合域(DBD)，包含2個鋅指結構,其與DNA編碼雌激素反應元件(EREs)密切相關；D區(qū)調(diào)節(jié)配體的結合、受體二聚化、核易位、泛素相關修飾因子(UMO)化和乙?；?；E區(qū)包含配體結合域(LBD)和AF-2；F區(qū)被認為是區(qū)分雌二醇(E2)和其他ERs激動劑的活動區(qū)。ER轉錄活性依賴于N-末端的兩個AFs：A/B區(qū)的AF-1受體和E區(qū)的AF-2。AF-1是非配體依賴性的，而AF-2則是配體依賴性的。當DBD區(qū)與DNA結合后,AF-1即可激活DNA轉錄活性,而AF-2與LBD區(qū)重疊,可與雌激素直接結合從而激活DNA的轉錄。雖然AF-1和AF-2可以獨立運行，當這兩者協(xié)同作用時才能實現(xiàn)ER的最大轉錄〔4,5〕。

成骨細胞具有兩個不同核受體超家族成員，即ERα和ERβ，相關配體通過與ERα及ERβ結合對成骨細胞發(fā)揮生物學效應，ERα和ERβ在DNA和配體結構域上有很高的同源性，兩種受體亞型已明確是由位于不同染色體上的不同基因編碼的蛋白質(zhì)，ERα由人6號染色體長臂編碼，ERβ由人14號染色體短臂編碼〔6〕。傳統(tǒng)觀點認為，雌激素通過結合ERα和ERβ，從而激活ER信號轉導途徑誘導成骨〔7〕。研究表明，ERs也能夠通過與某些信號通路之間的聯(lián)系促進成骨誘導。

1ER與骨保護素(OPG)/核因子(NF)-κB受體活化因子(RANK)/RANK配體(RANKL)信號通路

正常骨重建及骨吸收的穩(wěn)定主要依靠RANKL和OPG的平衡。RANKL是一類膜結合分子，屬于腫瘤壞死因子(TNF)配體家族成員，對破骨細胞形成至關重要。目前發(fā)現(xiàn)，RANKL具有兩種特異性受體：破骨細胞的前體細胞表面表達的膜信號受體RANK和分泌型誘餌受體OPG〔8〕。RANKL與RANK結合，上調(diào)破骨細胞靶基因表達，促進破骨細胞增殖及分化〔9〕。而OPG屬于TNF受體超家族成員，受各種激素、細胞因子及間充質(zhì)的轉錄因子調(diào)節(jié)。作為一種可溶性受體，OPG由間充質(zhì)干細胞(MSCs)及成骨細胞產(chǎn)生，可阻斷RANKL與RANK結合，從而抑制破骨細胞形成〔10〕。因此，OPG的高表達有利于BMCSs的成骨分化〔11〕。

雌激素可導致人類成骨細胞OPG和ER基因表達的mRNA和蛋白顯著增加。雌激素導致ER的表達和誘餌受體OPG的上調(diào)表明：成骨細胞可能參與調(diào)節(jié)雌激素所致的骨合成代謝。Bord等〔12〕將成骨細胞分組培養(yǎng)24 h后，低劑量(10-9mol/L)17β-E2組RANKL mRNA表達被抑制(P<0.05)，而高劑量(10-7mol/L)組則無變化(P>0.05);ERα、ERβ、OPG mRNA的表達在高劑量組無變化，僅ERα mRNA在低劑量時高表達。然而當加入ER拮抗劑ICI182,780與E2聯(lián)合干預24 h后，無論高、低劑量組均沒有出現(xiàn)OPG、RANKL、ER表達增高的情況。這說明，雌激素通過ER(主要是ERα)誘導成骨可能與OPG/RANK/RANKL通路的激活有關。

2ER和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2/smads信號通路

BMP-2屬于轉化生長因子(TGF)-β的超基因家族成員，在成骨細胞分化和骨形成方面具有重要作用〔13〕。約30個骨形成蛋白家族成員被鑒定，其中BMP-2被確定為一個調(diào)節(jié)成骨細胞分化的關鍵信號〔14〕。幾項利用轉基因小鼠的研究表明，BMP-2是參與骨固有再生能力的一個基本組成部分〔15〕，因此，BMP-2可以被認為是促進骨形成的某些促蛋白合成藥的一個潛在靶點。Mundy等〔16〕構建篩選模型,確定他汀類藥物作為有效的BMP-2激活劑,在體內(nèi)具有刺激骨形成的作用。此外，一些天然化合物包括蛇床子素、金雀黃素和淫羊藿苷等也能通過BMP-2通路對骨代謝發(fā)揮保護作用〔17~19〕。已知在MSCs中,BMP能誘導堿性磷酸酶(ALP)表達和成骨分化〔20〕。經(jīng)典的BMP-2/smads信號通路是BMP-2激活其信號轉導蛋白Smad中的受體調(diào)節(jié)型Smads(R-Smads：Smad1、Smad5、Smad8)使之與共同中介型Smads(Co-Smads：Smad4)形成復合體，轉移至細胞核內(nèi)對靶基因轉錄進行調(diào)節(jié)〔21〕。

Song等〔22〕發(fā)現(xiàn)辛伐他汀對ALP活性的刺激作用不完全是通過中和BMP-2被阻斷，ERα蛋白水平在辛伐他汀作用于小鼠BMCSs 72 h后上調(diào)。辛伐他汀對BMCSs ALP活性的增強可被ICI182,780阻斷，17β-E2和辛伐他汀聯(lián)用相比辛伐他汀可增加2~3倍ALP活性。這些結果表明，辛伐他汀誘導的小鼠BMCSs體外成骨，至少部分通過ERα及BMP-2途徑。

3ER和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路

PI3K由85 kD的調(diào)節(jié)亞基p85和110 kD的催化亞基p110兩個亞基構成，通過癌基因Ras和p110 直接結合、與具有磷酸化酪氨酸殘基的生長因子受體或連接蛋白相互作用引起二聚體構象改變兩種途徑被激活，在胞膜上產(chǎn)生第二信使3-磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，PIP3與胞質(zhì)內(nèi)的Akt結合，使Akt轉運到胞膜上而被活化。磷脂酰肌醇依賴蛋白激酶(PDK)1使Akt 蛋白蘇氨酸磷酸化位點(Thr308)磷酸化，同時哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTORC)2則使Akt蛋白的絲氨酸磷酸化位點(Ser473)磷酸化，Akt功能才充分激活，從而調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡等生理活動。Wang等〔23〕用葛根素干預成骨細胞MG-63，發(fā)現(xiàn)其ERα短發(fā)夾樣RNA(shRNA)、ERβ shRNA、ALP活性及膠原蛋白含量均上調(diào)，而ICI182,780和PI3K特異性抑制劑渥曼青霉素均能明顯下調(diào)葛根素誘導的成骨細胞磷酸化(P)Akt的表達，抑制其增殖、ALP活性及膠原蛋白含量。另有研究證明，ERα 與PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85結合后活化PI3K/Akt， 激活后的Akt能夠使ERα的絲氨酸殘基ser167磷酸化而被激活，因此可能存在ER/PI3K/Akt通路〔24〕。這些結果提示，PI3K/Akt通路對ERα的活性具有調(diào)節(jié)作用， 反過來ERα也可調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路的活性。

4ER和Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)

Wnt信號已被證明是一種促進MSCs向軟骨及成骨細胞分化的有效通路〔25〕。在經(jīng)典Wnt通路中，Wnt配體結合Frizzled受體及其共受體低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)5/6，使Dishevelled(Dsh)蛋白磷酸化，從而抑制下游的糖原合酶激酶(GSK)-3β Axin和大腸腺瘤息肉蛋白(APC)與磷酸化的β-catenin結合〔26〕。β-catenin作為T-細胞因子(TCF)和淋巴增強因子(LEF)的共同轉錄激活因子，成為經(jīng)典Wnt信號的關鍵部分。積聚在細胞質(zhì)的非磷酸化β-catenin易位至細胞核，結合轉錄因子TCF/LEF而調(diào)節(jié)下游Wnt信號靶基因的表達〔27〕。

17β-E2以ER依賴途徑通過Wnt通路轉錄效應器TCF增加基因啟動子活性，并能增加氯化鋰(LiCl)對TCF活性的刺激作用。氯化鋰能通過雌激素反應元件增加17β-E2的刺激作用，同時也會因一個非經(jīng)典的Wnt受體激動劑(WAG)進一步增強。而相比LiCl，WAG增加DNA的合成和減小相對膠原合成和ALP活性。此外，WAG抑制成骨特異性轉錄因子(Runx)2、Osterix(OSX)和ALP mRNA水平，并能有效誘導OPG mRNA表達。17β-E2和Wnt通路之間在蛋白質(zhì)水平存在明確的交集，其中ERα與β-catenin獨立結合的結構域TCF-4緊密關聯(lián)。McCarthy等〔28〕研究發(fā)現(xiàn)成骨細胞增殖、分化，涉及ERα和TCF-4的激活，受17β-E2和Wnt信號途徑共同影響。

5ER和絲裂原活化蛋白激酶(MEK)/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號通路

ERK包括ERK1和ERK2,是將信號從表面受體傳導至細胞核的關鍵，ERK是有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的一員，控制著細胞增殖、分化、死亡等多種生理過程。其基本信號傳遞遵循MAPK三級酶促級聯(lián)的特點：即上游激活蛋白→MAPK激酶的激酶(MAPKKK)→MAPK激酶(MAP-KK)→MAPK。在ERKs的傳遞途徑中Ras作為上游激活蛋白，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Raf)作為MAPKKK，MAPK/ERK激酶(MEK)作為MAPKK，即Ras-Raf-MEK-ERK途徑。

活化的ERK信號途徑是促進成骨細胞增殖的主要因素之一，已報道包括胰島素、糖皮質(zhì)激素、高壓氧、成纖維細胞生長因子(FGF)-6〔29~32〕在內(nèi)的諸多物質(zhì)可以通過ERK途徑促進成骨細胞增殖、分化。Song等〔33〕的數(shù)據(jù)表明，淫羊藿苷可以通過激活ERK通路促進成骨細胞增殖、分化和礦化，另外，淫羊藿苷作為一個植物雌激素可以激活ERs信號通路或與細胞核中ERs復合物進行合作而發(fā)揮生物學效應。Prouillet等〔34〕發(fā)現(xiàn)體外槲皮素和山柰酚能顯著提高成骨細胞ALP活性，而ICI182，780和ERK通路阻滯劑PD98059均能明顯抑制這種效應，ICI182，780能抑制黃酮所誘導的ERK的激活。以上數(shù)據(jù)表明，ER和MEK/ERK通路在成骨細胞中能夠相互依賴地發(fā)揮作用。Runx-2作為主要成骨轉錄因子參與成骨細胞成熟過程，并且它對骨鈣蛋白的表達起至關重要作用，OSX是一種新型的含鋅指轉錄因子，在骨發(fā)育中呈特異性表達，OSX位于Runx-2的下游，其表達依賴于Runx-2〔35〕，同時，以上信號通路均可調(diào)節(jié)Runx/OSX的表達〔36~39〕。

此外，各個信號通路間可以相互作用，影響成骨。研究發(fā)現(xiàn)〔40〕，Wnt信號活躍于各種成骨細胞及其前體細胞系中，包括MC3T3-E1、2T3、C2C12和C3H10T1/2細胞。Wnt可以被看作為BMP的一個上游調(diào)節(jié)因子，Wnt3a所致Wnt信號的激活和β-catenin/TCF4的過表達均能激活BMP-2基因在啟動子或mRNA水平上的轉錄。與此相反，成骨細胞中的BMP-2轉錄可以通過Wnt阻滯劑(DKK1)、血清分泌型卷曲蛋白(SFRP)4阻斷Wnt信通路或F-盒子蛋白1/β重組轉錄蛋白(FWD1/β-TrCP)、同位素編碼親和標記物(ICAT)、ΔTCF抑制β-catenin/TCF4活動而下降。Nie等〔41〕也發(fā)現(xiàn)OPG/RANK/RANKL通路與Wnt信號的相互作用關系。然而，上述信號途徑均與ER相關，因此調(diào)節(jié)ER的表達與BMSCs的成骨分化密切相關。

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〔2015-04-01修回〕

(編輯王一涵)

〔中圖分類號〕R592

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1267-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.110

通訊作者：殷明(1958-)，男，教授，博士生導師，主任醫(yī)師，主要從事創(chuàng)傷、脊柱研究。

1南昌大學研究生院醫(yī)學部2九江學院基礎醫(yī)學院

第一作者：林思文(1989-)，男，在讀碩士，主要從事創(chuàng)傷醫(yī)學研究。