郭倩楠，張文芳，賈小玉，殷 瑩，閆文懿，崔智慧，趙喜亭，2，3*

（1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007；2.河南省高校道地中藥材保育及利用工程技術(shù)研究中心，河南新鄉(xiāng) 453007；3.河南省綠色藥材生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng) 453007）

菊花病毒脫除及其檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

郭倩楠1，張文芳1，賈小玉1，殷 瑩1，閆文懿1，崔智慧1，趙喜亭1，2，3*

（1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007；2.河南省高校道地中藥材保育及利用工程技術(shù)研究中心，河南新鄉(xiāng) 453007；3.河南省綠色藥材生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng) 453007）

介紹感染菊花的2種主要優(yōu)勢(shì)病毒菊花B病毒（CVB）和番茄不孕病毒（TAV），從光合作用、N代謝水平及抗膜脂過氧化能力3個(gè)方面探討了病毒病對(duì)菊花產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，同時(shí)對(duì)菊花病毒的脫除及檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了比較概述，認(rèn)為超低溫療法在菊花病毒的脫除中具有良好的發(fā)展前景，芯片技術(shù)是菊花病毒快速檢測(cè)技術(shù)的重要發(fā)展方向。

菊花；病毒；脫毒技術(shù)；檢測(cè)技術(shù)

菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）為菊科菊屬多年生草本植物，中國(guó)十大名花之一，集觀賞、食用、藥用、茶飲為一體，具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值。生產(chǎn)上主要采用扦插、分株、嫁接等繁殖方法，但營(yíng)養(yǎng)繁殖易感染病毒病，對(duì)菊花質(zhì)量影響較大。然而防治菊花病毒病還沒有特效藥，目前采用病毒脫除技術(shù)獲得無毒苗。菊花脫毒技術(shù)主要有莖尖培養(yǎng)及結(jié)合熱處理、超低溫療法。檢測(cè)技術(shù)主要有指示植物法、電鏡觀察法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、分子生物學(xué)（單一RT-PCR、多重RTPCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、熒光環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增RT-LAMP）技術(shù)。

1 病毒病對(duì)菊花的為害

1.1 侵染菊花的主要病毒

世界范圍感染菊花的病毒已有20多種［1］，在我國(guó)主要有菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、煙草花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、馬鈴薯X病毒（Potato virus X）、馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y）、番茄斑萎病毒（TSWV）、菊花矮化類病毒（CSVD）等8種［2-3］。CVB和TAV是感染菊花的優(yōu)勢(shì)病毒［4-5］，能感染包括墨菊、懷菊、瓜葉菊、野菊、金魚草、金盞菊、翠菊、蠟菊及羅納菊等多種菊花［6］。TAV在1949年于馬鈴薯中首次被發(fā)現(xiàn)［7］，為RNA病毒，屬于雀麥花葉病毒科黃瓜花葉病毒屬，通過汁液和蚜蟲非持久式傳播，造成菊花植株矮化、花變形、無葉片及生殖能力喪失等［8］。CVB于1952年被鑒定出是單鏈正義RNA病毒，屬于線性病毒科香石竹潛隱病毒屬，通過插條和汁液進(jìn)行傳播，使感染的菊花葉呈斑駁狀或壞死斑［8-9］。其在菊花上的鈍化溫度為70～80℃，稀釋終點(diǎn)為10-2～10-4［10］。

1.2 病毒病對(duì)菊花品質(zhì)和產(chǎn)量的影響

菊花為世界“四大切花”之一，銷量居首。但常因受到病毒侵染而使其生理生化活動(dòng)受到影響，進(jìn)而造成菊花品質(zhì)和產(chǎn)量大幅下降。病毒對(duì)菊花生理生化的影響主要表現(xiàn)在光合作用、N代謝水平及抗膜脂過氧化能力3個(gè)方面。

病毒感染菊花后葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能均受到損傷，光合能力下降。脫除CVB的杭白菊葉綠素含量、光合作用能力均明顯增加［11］。脫除TAV、PVY后，亳菊葉綠素含量明顯增加，且葉片較寬［12］。九月菊在脫毒后表現(xiàn)為植株粗壯、葉片寬等生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)［13］。

N代謝是植物重要的生理生化過程，衡量指標(biāo)主要有硝酸還原酶（Nitrate reductase，NR）的活性、可溶性蛋白的含量及游離脯氨酸的含量。N代謝的正常進(jìn)行能使植株免受硝酸鹽的毒害，進(jìn)而長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良。小黃菊脫除TAV后，其游離脯氨酸含量及NR活性均提高，N代謝能力增強(qiáng)［2］。

植物感染病毒后膜脂過氧化程度加劇、保護(hù)酶活性降低、產(chǎn)量和品質(zhì)大幅下降。與未脫除TAV病毒的小黃菊株系相比，脫除TAV后，丙二醛（MAD）、H2O2含量及O2·-生成速率均顯著降低，保護(hù)酶（超氧化物岐化酶SOD、過氧化物酶POD、過氧化氫酶CAT、抗壞血酸過氧化物酶APX、硝酸還原酶GR）的活力均顯著增高，藥用成分綠原酸的含量增幅在7.6%～39.7%、木犀草苷的含量增幅在15.7%～62.6%［2］。懷白菊脫除TAV后，O2·-生成速率、MDA的含量降幅最大值超30%，APX活性升高幅度最高值也超50%，產(chǎn)量和品質(zhì)均得到顯著改善［14］。綜上，病毒感染菊花引起光合作用下降、N代謝水平和抗膜脂過氧化能力降低，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。

2 菊花脫毒技術(shù)的研究現(xiàn)狀

目前菊花病毒病大多采用農(nóng)藥防治，而農(nóng)藥的使用會(huì)造成土壤污染、農(nóng)藥殘留以及病毒抗藥性增強(qiáng)的問題。病毒的抗藥性使農(nóng)藥用量加大，形成惡性循環(huán)，而菊花病毒的脫除技術(shù)是一項(xiàng)傳統(tǒng)的綠色環(huán)保技術(shù)，能使菊花提純復(fù)壯，增強(qiáng)對(duì)病毒的抗性。有關(guān)菊花病毒的脫除技術(shù)主要有莖尖培養(yǎng)，以及結(jié)合熱處理和超低溫療法。

2.1 莖尖培養(yǎng)及其結(jié)合熱處理

莖尖培養(yǎng)是傳統(tǒng)的菊花脫毒技術(shù)之一。Morel等［15］于1952年對(duì)大麗菊的花葉病毒脫除中而建立。莖尖培養(yǎng)是利用植物莖尖含極少病毒或幾乎不含病毒（即免疫區(qū)）而進(jìn)行的組織培養(yǎng)［16-17］。一般來說，莖尖越短，其病毒含量越少，脫毒效率越高，但植物的成活率降低，因而對(duì)于不同品種的菊花其莖尖的切取長(zhǎng)度還需通過試驗(yàn)來進(jìn)行探究。當(dāng)莖尖長(zhǎng)度短于0.3 mm時(shí)，菊花品種寒小白CVB的脫毒效率高達(dá)66.7%，但成活率低至6%；而當(dāng)莖尖長(zhǎng)度為0.7～1.0 mm時(shí)，成活率最高（90%），但脫毒率最低（僅為6.67%）［18］；當(dāng)莖尖長(zhǎng)度為0.4～0.5 mm時(shí)，墨菊CMV、CVB、TMV脫毒率較好分別為61.9%、63.2%、55.0%，莖尖成活率為66.7%［19］。

雖然莖尖培養(yǎng)法成本低，無污染，但由于莖尖十分小，很難剝離，因此在操作技術(shù)上有很大困難。故而常采用莖尖結(jié)合熱處理來脫除菊花的病毒。

熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)法利用熱處理能使植物頂端免疫區(qū)擴(kuò)大，可切取較長(zhǎng)的莖尖，因而操作難度得以降低，同時(shí)莖尖再生苗的成活率也大大增加。對(duì)墨菊分別進(jìn)行莖尖培養(yǎng)、莖尖結(jié)合熱處理，脫除CVB的比率分別為63.2%和86.7%［19］。利用熱處理及莖尖結(jié)合熱處理對(duì)菊花TAV進(jìn)行脫除，脫毒率分別為20%和60%［20］。以上說明，莖尖結(jié)合熱處理是一種較好的脫毒方法。

2.2 超低溫療法

超低溫療法是一種以超低溫保存（Cryopreservation）與植物組織培養(yǎng)相結(jié)合的新型植物脫毒技術(shù)。原理為：在低溫下，病毒所在的植物細(xì)胞液泡中水分含量高，易產(chǎn)生結(jié)晶殺死病毒，而分生組織胞質(zhì)濃，抗凍性強(qiáng)，易存活［21］。該技術(shù)已應(yīng)用于許多植物的病毒脫除中，如香蕉的CMV脫除率為30%［22］、葡萄的葡萄A病毒（GVA）的脫毒率為97%［23］、柑橘的黃龍病菌（HLB）的脫除率高達(dá)90.9%～94.3%［24］。在菊花上，低溫療法主要運(yùn)用在種質(zhì)資源的保存上，在脫毒方面的研究報(bào)道較少。但因該技術(shù)處理周期短且能很好地保持植物的遺傳穩(wěn)定性，因而在菊花病毒的脫除中具有良好的發(fā)展前景。研究表明，運(yùn)用該方法脫除非洲菊妃子CMV和TMV，脫除率為100%［25］。

3 菊花病毒檢測(cè)技術(shù)的研究現(xiàn)狀

將菊花進(jìn)行脫毒再生后，檢測(cè)脫毒苗的脫毒狀況是必要的，因?yàn)椴《镜臋z測(cè)可以說明菊花的脫毒方法是否有效，從而為下一步工作打下基礎(chǔ)。檢測(cè)菊花病毒的技術(shù)主要有指示植物法、電鏡觀察法、酶聯(lián)免疫吸附法和分子生物學(xué)方法。

3.1 指示植物法

指示植物（生物學(xué)檢測(cè)法）是比較傳統(tǒng)，也是早期使用的一種檢測(cè)植物感染病毒與否的技術(shù)，是根據(jù)病毒能夠侵染特定的寄主并使寄主產(chǎn)生特定的癥狀類型而進(jìn)行檢測(cè)的方法［26］。病毒侵染菊花后常出現(xiàn)花葉、條紋、斑駁、矮化、枯斑、畸形等明顯癥狀［27］。常用的方法包括汁液摩擦接種［28］和嫁接傳染［29］。

指示植物法操作簡(jiǎn)單，且結(jié)果直觀，但在自然環(huán)境中，菊花常受到多種病毒侵染，因而很難根據(jù)指示植物的癥狀鑒定出病毒的確切種類。

3.2 電鏡觀察法

電鏡觀察法是在電子顯微鏡下觀察病毒粒子的大小及病毒外殼蛋白的形狀，從而鑒定出病毒的技術(shù)［30］。自Kausche等［31］首次在電鏡下看到TMV以來，電鏡已成為植物病毒研究必不可少的手段之一。因電子的穿透力低，所以常用超薄切片技術(shù)結(jié)合免疫電鏡才能鑒定出病毒。利用醋酸氧鈾負(fù)染，在電鏡下發(fā)現(xiàn)了TAV［32］。CMV的6個(gè)不同株系的區(qū)分利用了負(fù)染、超薄切片技術(shù)與電鏡技術(shù)相結(jié)合［33］。

電鏡法的優(yōu)點(diǎn)是能夠準(zhǔn)確且較靈敏的檢測(cè)菊花病毒，然而此方法需要先進(jìn)的儀器設(shè)備，花費(fèi)大，且須掌握準(zhǔn)確的操作技術(shù)。

3.3酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是一種靈敏且能大量檢測(cè)植物病毒的技術(shù)。其原理為：將待測(cè)物加入到酶與抗體或抗原結(jié)合的復(fù)合物中，依據(jù)底物的顯色反應(yīng)來判斷待測(cè)物是否有病毒及其種類［34］。目前應(yīng)用最多的是雙抗體夾心法（DAS-ELISA）和A蛋白雙抗夾心法（PAS-ELISA）。經(jīng)DAS-ELISA法，檢測(cè)出菊花的4個(gè)品種均感染CVB，其中1種還感染TAV［35］。利用DAS-ELISA法能鑒定出菊花的TAV［36］。此外，利用PAS-ELISA也檢測(cè)出杭白菊中含有菊花B病毒［11］。

酶聯(lián)免疫吸附法因靈敏度高、特異性強(qiáng)被廣泛使用在菊花病毒的檢測(cè)中，但該技術(shù)只能檢測(cè)1種病毒，且會(huì)出現(xiàn)假陰性。

3.4分子生物學(xué)法

分子生物學(xué)檢測(cè)法是通過檢測(cè)病毒核酸（DNA或RNA）來證實(shí)病毒的存在，主要包括核酸雜交技術(shù)、雙鏈RNA（dsRNA）電泳技術(shù)及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）。在菊花上主要應(yīng)用RT-PCR技術(shù)。

RT-PCR法比酶聯(lián)免疫吸附法更為靈敏，并能檢測(cè)多種菊花病毒的脫毒技術(shù)。其原理是以RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄出cDNA，然后在體外經(jīng)PCR擴(kuò)增，根據(jù)電泳圖譜分析來檢測(cè)植物感染病毒與否［2］。隨著RT-PCR技術(shù)的發(fā)展，RT-PCR技術(shù)又分為單一RT-PCR、多重RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR及RT-LAMP技術(shù)。

3.4.1 單一RT-PCR

指利用一種病毒的引物，轉(zhuǎn)錄出cDNA后再用PCR擴(kuò)增，從而檢測(cè)出病毒的技術(shù)。其特點(diǎn)是只能檢測(cè)1種病毒。懷菊花TAV病毒的檢測(cè)［2］及CVB的鑒定［1］就是利用此方法。

3.4.2 多重RT-PCR

指能在一個(gè)反應(yīng)體系中加入多種病毒引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，從而檢測(cè)多種病毒的檢測(cè)技術(shù)。因菊花在自然條件下常受到病毒的復(fù)合感染，所以該方法在現(xiàn)階段較為流行。利用二重RT-PCR能同時(shí)檢測(cè)出菊花的CVB和TAV［37］。利用四重RT-PCR能檢測(cè)菊花2種病毒（CVB和TVA），以及2種類病毒，CSVD和菊花枯黃斑點(diǎn)類病毒（CChMVd）［38］。目前該技術(shù)能一次檢測(cè)出菊花的5種病毒（TAV、CVB、CMV、TMV和PVY）及2種類病毒（CSVD，CChMVd）［39］。

3.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

是一種利用熒光探針與PCR反應(yīng)產(chǎn)物雜交后所產(chǎn)生的熒光量定量檢測(cè)植物病毒的技術(shù)。該技術(shù)既能避免假陽性的出現(xiàn)，也能定量檢測(cè)病毒。利用該方法可檢測(cè)至少50 fg的TSWV［40］。菊花病毒（CMV、TMV）和類病毒（PVY）的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)體系已成功建立［41］。

3.4.4 RT-LAMP技術(shù)

是一種于21世紀(jì)初建立的新型檢測(cè)病毒的手段。在60～65℃等溫條件下，LAMP能在具有鏈置換活性的DNA聚合酶下識(shí)別目的基因6個(gè)區(qū)段的4條引物，進(jìn)而擴(kuò)增目的基因［42］。由于該技術(shù)能一次性快速地反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增RNA病毒，所以在菊花病毒檢測(cè)中得到快速發(fā)展。在菊花TSWV檢測(cè)中，RT-LAMP的靈敏度比RT-PCR高出100倍［43］。此外，在菊花TAV的檢測(cè)中也發(fā)現(xiàn)，RTLAMP比RT-PCR更靈敏［44］。目前已在單一RTLAMP技術(shù)上發(fā)展出多重RT-LAMP。Liu等［45］于2014年建立了菊花CVB和CSVD的二重RT-LAMP技術(shù)。

4 問題及展望

菊花品種不同，脫毒技術(shù)不盡相同。菊花品種繁多，遺傳背景復(fù)雜，加之長(zhǎng)期的營(yíng)養(yǎng)繁殖使病毒感染嚴(yán)重，同時(shí)大面積生產(chǎn)時(shí)，連作也會(huì)造成病毒富集而大量減產(chǎn)。因此，根據(jù)不同菊花品種建立更為有效的脫毒技術(shù)是研究的重要課題。國(guó)際上迅速發(fā)展的芯片技術(shù)，是將大量DNA探針片段有序地固化于支持物表面，與已標(biāo)記的DNA分子雜交，再對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)分析，從而識(shí)別樣品中存在的特異性核酸序列［1］。此法是DNA雜交技術(shù)與熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的基因水平檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高和可靠性強(qiáng)的特點(diǎn)，是菊花病毒快速檢測(cè)技術(shù)的重要發(fā)展方向［46］。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S436.8

：A

：0528-9017（2016）12-2035-04

文獻(xiàn)著錄格式：郭倩楠，張文芳，賈小玉，等.菊花病毒脫除及其檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（12）：2035-2039.

10.16178/j.issn.0528-9017.20161234

2016-08-18

國(guó)家自然科學(xué)基金（31372105）；河南師范大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（20140134）

郭倩楠（1993—），女，河南洛陽人，在讀本科，生物科學(xué)專業(yè)，E-mail：237074891@qq.com。

趙喜亭（1971—），女，河南洛陽人，副教授，博士，從事植物生理與生物技術(shù)的教學(xué)與科研工作，E-mail：zhaoxt0411 @126.com。