吳雪雷，　蔡耀武，　莊志忠，　陳園靜，　郭仁杰，　鄭茂松

(莆田學(xué)院附屬莆田市第一醫(yī)院 1腫瘤外科， 2病理科，福建 莆田 351100)

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EZp對(duì)胃癌細(xì)胞核因子 κB靶基因的調(diào)節(jié)作用

吳雪雷1△，蔡耀武1，莊志忠1，陳園靜1，郭仁杰2，鄭茂松1

(莆田學(xué)院附屬莆田市第一醫(yī)院1腫瘤外科，2病理科，福建 莆田 351100)

[摘要]目的： 探討zeste同源物增強(qiáng)子2 (EZp) 蛋白的表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞的影響以及可能的作用機(jī)制。方法: 用real-time PCR 和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)正常胃黏膜上皮細(xì)胞和不同胃癌細(xì)胞系中EZp的mRNA和蛋白表達(dá)；采用細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞遷移以及軟瓊脂增殖實(shí)驗(yàn)測(cè)定EZp對(duì)胃癌細(xì)胞系致癌能力的影響；利用螢光素酶報(bào)告基因和real-time PCR檢測(cè)EZp對(duì)核因子κB靶基因的調(diào)節(jié)作用；用免疫共沉淀法檢測(cè)EZp和p65的相互作用。結(jié)果: 與正常胃上皮細(xì)胞相比，胃癌細(xì)胞系中的EZp過(guò)量表達(dá)(P<0.05)。EZp特異性抑制劑腺苷類(lèi)似物DZNep處理或shEZp抑制了AGS和SNU-16細(xì)胞系的細(xì)胞活力。此外，DZNep和shEZp 抑制了AGS細(xì)胞遷移及軟瓊脂細(xì)胞形成的克隆數(shù)目(P<0.05)。shEZp 下調(diào)了核因子κB報(bào)告基因或白細(xì)胞介素8報(bào)告基因的活性以及核因子κB靶基因白細(xì)胞介素8、趨化因子配體5及趨化因子配體20的表達(dá)(P<0.05)。此外，EZp可以特異性與p65蛋白相互作用。結(jié)論: EZp 通過(guò)調(diào)節(jié)核因子κB靶基因介導(dǎo)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

[關(guān)鍵詞]胃癌； Zeste同源物增強(qiáng)子2； 核因子κB

流行病學(xué)研究顯示，幽門(mén)螺旋桿菌(Helicobacterpylori)感染引起的慢性炎癥與胃癌的發(fā)生有著緊密的關(guān)聯(lián)[1-2]。幽門(mén)螺旋桿菌可分泌多種毒力因子，比如細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白 (cytotoxin-associated gene A, CagA)、空泡細(xì)胞毒素(vacuolating cytotoxin A, VacA)等。而之前的數(shù)據(jù)顯示核因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)介導(dǎo)慢性炎癥的發(fā)生。有研究表明CagA可激活核因子κB信號(hào)通路上調(diào)其下游的靶基因，包括細(xì)胞白介素(interleukin, IL)-1β、IL-6、IL-8以及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)。而這些細(xì)胞因子可誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，從而促進(jìn)腫瘤的生成[3-4]。

越來(lái)越多的研究認(rèn)為表觀(guān)遺傳對(duì)于腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的調(diào)節(jié)作用。Zeste同源物增強(qiáng)子2(enhancer of zeste homolog 2, EZp)蛋白是多梳蛋白抑制復(fù)合體2(polycomb repressive complex 2, PRC2)中的組分之一，可特異性催化組蛋白p第27個(gè)賴(lài)氨酸三甲基化(pK27me3)。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示EZp在胃癌組織中高表達(dá)與相關(guān)研究的結(jié)果一致[5-7]。本研究基于前人已有的信息探討胃癌細(xì)胞系中核因子κB通路與EZp的關(guān)聯(lián)，以及潛在的分子機(jī)制。

材料和方法

1材料與試劑

人胚腎細(xì)胞293T、人胃上皮細(xì)胞GES-1和人胃癌細(xì)胞AGS、 MKN-45、SNU-16、NCI-N87購(gòu)自上海生博生物醫(yī)藥；DZNep是Selleck產(chǎn)品；EZp抗體是BD產(chǎn)品；T345磷酸化EZp 抗體購(gòu)自Active Motif；V5和β-actin抗體、V5和HA抗體偶聯(lián)珠子、pLKO-shLuc 和shEZp(5’-ATTCTTGGTTTAAGATTTCCG-3’) 購(gòu)自Sigma；HA抗體購(gòu)自Santa Cruz；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、Superscript III反轉(zhuǎn)錄酶、TRIzol、SYBR Green 購(gòu)自Invitrogen；MTS試劑盒、Dual-Luciferase Reporter為Promega產(chǎn)品； Difco Noble 瓊脂為BD產(chǎn)品；TNF-α購(gòu)自R&D；pCMV-HA-EZp購(gòu)自Addgene；pcDNA-V5-p65 cDNA克隆自293T細(xì)胞。

2方法

2.1慢病毒包裝與感染使用磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。將細(xì)胞接種于100 mm培養(yǎng)皿中， 24 h后轉(zhuǎn)染10 μg pLKO-shLuc或者pLKO-shEZp, 8 μg pCMV-ΔR8.2和2 μg pCMV-VSV-G。轉(zhuǎn)染16 h后換成新鮮培養(yǎng)液。48 h后收集病毒上清并用0.45 μm 過(guò)濾器過(guò)濾并分裝冷凍于-80 ℃。AGS和SNU-16細(xì)胞培養(yǎng)于60 mm， 24 h后去掉培養(yǎng)液，加入2 mL含有5 mg/L 聚凝胺(polybrene)的慢病毒。感染12 h后，換成新鮮培養(yǎng)液，再過(guò)36 h后用2 mg/L的嘌呤霉素(puromycin)篩選細(xì)胞。

2.2MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力將AGS和SNU-16細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)液。 培養(yǎng)24 h后換成分別含有0.25 μmol/L、 0.5 μmol/L、 1 μmol/L和 2 μmol/L DZNep的新鮮培養(yǎng)液，溶劑對(duì)照組加入相同體積的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)。72 h后向每孔加入20 μL MTS試劑，于培養(yǎng)箱中孵育2 h。然后用酶標(biāo)儀測(cè)定各樣品在490 nm波長(zhǎng)下的吸光度(A) 值，并計(jì)算相對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)率。 生長(zhǎng)率(%) =加藥孔A值/對(duì)照孔A值×100%。

2.3細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)AGS shLuc對(duì)照細(xì)胞和shEZp細(xì)胞以每孔5×105接種于6孔板中， 每孔加入2 mL培養(yǎng)液。24 h后(約有95%融合率)用20 μL tip頭用力均勻地在孔中劃痕。PBS洗滌2次，加入RPMI-1640培養(yǎng)液。在不同的時(shí)點(diǎn)測(cè)量細(xì)胞遷移的距離。細(xì)胞遷移率 (%) =不同時(shí)點(diǎn)劃痕距離/0 h劃痕距離×100%。

2.4軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)于6孔板中加入0.6% Noble 瓊脂，于室溫冷卻40 min后，加入含0.3% Noble瓊脂的5 000個(gè)AGS shLuc對(duì)照細(xì)胞和shEZp細(xì)胞。每種細(xì)胞接種3個(gè)孔。室溫冷卻30 min后，6孔板于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4周后倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)含16個(gè)細(xì)胞以上的克隆。

2.5螢光素酶報(bào)告基因活性的檢測(cè)AGS細(xì)胞以1×108/L 鋪于24孔板中。24 h后轉(zhuǎn)染每孔20 pmol的對(duì)照小干擾RNA和EZp小干擾RNA(5’-ATTCTTGGTTTAAGATTTCCG-3’)。培養(yǎng)24 h后換成新鮮培養(yǎng)液，再轉(zhuǎn)染 0.4 μg的NF-κB報(bào)告基因或IL-8報(bào)告基因，以及0.1 μg陽(yáng)性對(duì)照Renilla螢光素酶報(bào)告基因。 24 h后加入含有50 μg/L TNF-α培養(yǎng)液孵育5 h。之后去除培養(yǎng)液加入50 μL PLB裂解液裂解細(xì)胞與室溫孵育20 min。每個(gè)樣品取5 μL于白色不透明96孔板中以雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光活性。各組相對(duì)熒光活性=核因子κB或IL-8報(bào)告基因熒光強(qiáng)度/Renilla熒光強(qiáng)度。

2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR人正常胃黏膜細(xì)胞以及胃癌細(xì)胞系以 2×108/L培養(yǎng)于 60 mm 培養(yǎng)皿中。24 h后去掉培養(yǎng)基，加入1 mL TRIzol裂解提取總RNA。 1 μg總RNA用SuperScript III反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。20 μL的反應(yīng)體系含10 μL 2×SYBR Green, 2 μL 引物，1 μL cDNA以及7 μL 去離子水。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 20 s; 95 ℃ 3 s, 60 ℃ 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。所有PCR反應(yīng)均在A(yíng)BI 7500 Fast Real-Time PCR System上進(jìn)行?；蛘?，AGS細(xì)胞鋪板24 h后，加入50 μg/L TNF-α，分別于不同的時(shí)點(diǎn)收集細(xì)胞。TRIzol裂解提取總RNA。1 μg總RNA用SuperScript III反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。EZp的上游引物序列為5’-AATCAGAGTACATGCGACTGAGA-3’， 下游引物序列為5’-GCTGTATCCTTCGCTGTTTCC-3’；IL-8的上游引物序列為5’-GACCACACTGCGCCAACAC-3’， 下游引物序列為5’-CTTCTCCACAACCCTCTGCAC-3’； CXCL5的上游引物序列為5’-AGCTGCGTTGCGTTTGTTTAC-3’，下游引物序列為5’-TGGCGAACACTTGCAGATTAC-3’；CCL20的上游引物序列為5’-CTGGCTGCTTTGATGTCAGT-3’， 下游引物序列為5’-CGTGTGAAGCCCACAATAAA-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’， 下游引物序列為5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’。

2.7免疫共沉淀和Western blot實(shí)驗(yàn)293T細(xì)胞鋪板于6 cm培養(yǎng)皿24 h后，共轉(zhuǎn)染4 μg pCMV-HA-EZp和/(或) 4 μg pcDNA3-V5-p65，用空載體pc-DNA3平衡總DNA量。36 h后，收集細(xì)胞并用RIPA裂解液裂解。收集上清，加入10 μL V5或者HA抗體偶聯(lián)的珠子于4 ℃孵育2 h。1 000 r/min離心 1 min, 用RIPA裂解液洗3次，去上清并加入50 μL 2×樣品液于95 ℃煮5 min。收集上清用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)分離。接著電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，室溫用5%脫脂牛奶封閉1 h，加入I抗4 ℃孵育過(guò)夜，用含0.1% 吐溫 20 的TBS緩沖液漂洗3次，每次5 min。加入相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的 II 抗室溫孵育1 h后，化學(xué)發(fā)光試劑孵育 5 min，暗室曝光顯影。β-actin作為內(nèi)參照。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。顯著性差異檢驗(yàn)采用單因素方差分析及Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1胃癌細(xì)胞系中EZp mRNA和蛋白的表達(dá)

我們首先比較了4種不同的人胃癌細(xì)胞系與正常胃黏膜上皮細(xì)胞中EZp的mRNA表達(dá)水平，4種胃癌細(xì)胞EZp的mRNA表達(dá)水平均比正常細(xì)胞高(P<0.01)。同樣通過(guò)Western blot檢測(cè)EZp總蛋白水平，胃癌細(xì)胞中的表達(dá)高于正常細(xì)胞(P<0.05)，同時(shí)檢測(cè)EZp T345磷酸化發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與總蛋白呈正相關(guān)，且正常胃上皮細(xì)胞的磷酸化EZp表達(dá)較弱(P<0.05)，見(jiàn)圖1。以上結(jié)果說(shuō)明EZp可能對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)以及致癌能力有調(diào)節(jié)作用。由于A(yíng)GS和SNU-16中的表達(dá)水平相對(duì)較高，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)均用其作為研究對(duì)象。

Figure 1.The expression of EZp in normal gastric epithelial cells and different gastric cancer cell lines. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsGES-1.

圖1正常人胃上皮細(xì)胞與不同胃癌細(xì)胞EZp mRNA和蛋白的表達(dá)水平

2抑制EZp或沉默EZH2對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

胃癌細(xì)胞AGS和SNU-16接種于96孔板后，以不同濃度DZNep處理72 h， MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EZp抑制劑對(duì)細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示，DZNep抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)呈劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)劑量達(dá)到2 μmol/L時(shí)，對(duì)AGS和SNU-16細(xì)胞的抑制率分別為(46.62±3.47)%和(43.78±2.58)%(P<0.01)。Western blot證明了DZNep對(duì) EZp蛋白表達(dá)的抑制呈濃度依賴(lài)性關(guān)系。類(lèi)似地， 利用慢病毒將EZH2 shRNA導(dǎo)入2種胃癌細(xì)胞，puromycin篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)shEZp的細(xì)胞株，Western blot檢測(cè)到EZp表達(dá)水平降低。shRNA介導(dǎo)的EZp沉默抑制了胃癌細(xì)胞的增殖,見(jiàn)圖2。

Figure2.TheeffectsofEZH2inhibitororEZpsilencingoncellactivity.A:inhibitoryeffectofDZNeponAGSandSNU-16cellactivity;B:DZNepdown-regulatedEZH2proteinexpressioninadose-dependentmanner;C:knockdownofEZpinAGSandSNU-16cells;D:knockdownofEZpdecreasedtheactivityofAGSandSNU-16cells.Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L;#P<0.05 vsshLuc.

圖2EZH2抑制劑或EZp沉默對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

3抑制EZH2或沉默EZp對(duì)細(xì)胞遷移和集落形成的影響

以穩(wěn)定表達(dá)對(duì)照shRNA和EZpshRNA的AGS細(xì)胞為對(duì)象做細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。劃痕后18h，對(duì)照組細(xì)胞的遷移率為(79.21±3.26)%， 而EZpshRNA細(xì)胞的遷移率為(47.85±4.89)%，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。36h后，對(duì)照組細(xì)胞劃痕完全消失即達(dá)到100%的遷移率，但是EZp 沉默細(xì)胞為81.54%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組細(xì)胞形成較多的細(xì)胞克隆，克隆體積較大，而EZpshRNA細(xì)胞形成的細(xì)胞克隆顯著減少且沒(méi)有較大的克隆體積(P<0.05)。同樣，以EZH2抑制劑DZNep處理的細(xì)胞形成的細(xì)胞集落不管是數(shù)量還是體積均比DMSO處理細(xì)胞要少而小(P<0.05)，見(jiàn)圖3。這說(shuō)明EZH2增強(qiáng)AGS細(xì)胞的集落形成能力，使癌細(xì)胞的惡性度降低。

Figure3.SilencingofEZporinhibitionofEZH2reducedcellmigrationandcolonyformation(×40).A:shEZH2inhibitedAGScellmigrationinscratchassay;B:shEZH2AGScellsshowedlessandsmallercoloniesinanchorage-independentassay;C:DZNepreducedcolonynumberandsize.Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P<0.01vsshLuc or DMSO.

圖3 EZp 沉默或EZH2 抑制劑對(duì)細(xì)胞遷移和集落形成的影響

4EZH2對(duì)NF-κB靶基因的影響

分別利用不同的螢光素酶報(bào)告基因NF-κB-Luc和IL-8-Luc，我們發(fā)現(xiàn) EZp 沉默抑制了TNF-α介導(dǎo)的啟動(dòng)子激活作用(P<0.01)。另外，通過(guò)實(shí)時(shí)螢光定量PCR法檢測(cè)NF-κB靶基因IL-8、CXCL5和CCL20的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在TNF-α處理4h后，與對(duì)照組相比，EZpshRNA下調(diào)了上述3個(gè)基因的mRNA表達(dá)(P<0.05)。以上結(jié)果顯示EZH2對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞中核因子κB靶基因具有正調(diào)節(jié)作用,見(jiàn)圖4。

5EZH2與NF-κBp65的相互作用

利用免疫共沉淀驗(yàn)證EZH2與p65在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是否相互作用。結(jié)果顯示，在V5-p65的沉淀產(chǎn)物中可以檢測(cè)到HA-EZH2，而在對(duì)照組中則檢測(cè)不到。同樣，在HA-EZH2的沉淀產(chǎn)物中可以檢測(cè)到V5-p65，但是對(duì)照組沒(méi)有檢測(cè)到蛋白,見(jiàn)圖5。這表明V5-p65與HA-EZH2在細(xì)胞中具有特異性的蛋白相互作用。

討論

越來(lái)越多的研究證實(shí)了幽門(mén)螺旋桿菌對(duì)于胃癌的發(fā)生起到誘因作用。幽門(mén)螺旋桿菌通過(guò)其自身分泌的毒力因子誘使慢性炎癥的形成。已有的證據(jù)認(rèn)為核因子κB對(duì)胃癌具有促進(jìn)作用[4]。然而，核因子κB是如何參與調(diào)節(jié)炎癥及惡性腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制仍然不清楚。有報(bào)道表明核因子κB通過(guò)調(diào)節(jié)其下游的靶基因促進(jìn)炎癥發(fā)生和腫瘤的生成[8-10]。

近年來(lái)表觀(guān)遺傳學(xué)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中的調(diào)節(jié)作用受到了越來(lái)越多的關(guān)注。EZH2是PRC2復(fù)合體中的甲基轉(zhuǎn)移酶催化活性成分，在許多不同類(lèi)型的腫瘤中過(guò)表達(dá)[11]。在胃癌中，EZH2通過(guò)抑制抑癌微小RNAs(microRNAs)，比如miR-1246、miR-302a、miR-4448、miR-200和miR-429，或者下調(diào)RUNX3轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，增強(qiáng)致癌能力[12-14]。此外，EZH2的翻譯后修飾也參與調(diào)解其活性[15]。

基于前人的研究，本文主要探討EZH2與核因子κB轉(zhuǎn)錄因子之間潛在的關(guān)系。我們?cè)谝幌盗械奈赴┘?xì)胞中證實(shí)了EZH2總蛋白和蛋白磷酸化的過(guò)表達(dá), 而正常胃上皮細(xì)胞的表達(dá)水平較弱。不同的研究說(shuō)明EZH2蘇氨酸345和487磷酸化對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移具有促進(jìn)作用[15]。EZpshRNA沉默抑制了癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和致癌力。同樣，小分子抑制劑DZNep處理胃癌細(xì)胞24h, 誘導(dǎo)濃度依賴(lài)性的EZH2降解。DZNep抑制細(xì)胞增殖和集落形成。TNF-α可誘導(dǎo)與炎癥相關(guān)的基因包括細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，而核因子κB是關(guān)聯(lián)TNF-α信號(hào)通路與下游基因的媒介物。有研究表明核因子κB的靶基因IL-8、CXCL5以及 CCL20可促進(jìn)局部炎癥發(fā)生，細(xì)胞異常增殖，最終導(dǎo)致腫瘤的形成、遷移和侵襲。這些細(xì)胞因子一方面可招募炎癥細(xì)胞到上皮細(xì)胞周?chē)?，而炎癥細(xì)胞分泌的其它細(xì)胞因子可促進(jìn)上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，另一方面可直接激活上皮細(xì)胞內(nèi)促生存的相關(guān)信號(hào)通路[4,16-17]。本研究顯示，抑制EZp的表達(dá)顯著下調(diào)了核因子κB的轉(zhuǎn)錄活性以及上述細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)水平。之前的報(bào)道聲稱(chēng)在三陰性乳腺癌細(xì)胞中EZH2特異性地與p65相互作用并促進(jìn)p65結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子比如IL-6、IL-8以及TNF-α，增強(qiáng)細(xì)胞因子的表達(dá)從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖[18]。本研究發(fā)現(xiàn)IL-8、CXCL5和CCL20同樣能被EZH2調(diào)控。通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的EZH2和核因子κB組分p65相互作用。EZH2可能是通過(guò)相似的機(jī)制達(dá)到調(diào)節(jié)作用。EZH2是組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，具有催化活性。Lee等[18]的數(shù)據(jù)顯示在特定乳腺癌細(xì)胞中EZH2對(duì)核因子κB靶基因的調(diào)節(jié)不依賴(lài)于其酶活性。在胃癌細(xì)胞中，我們不能排除EZH2可能通過(guò)其酶活性調(diào)節(jié)核因子κB下游基因的表達(dá)。將來(lái)需要進(jìn)一步的研究以證實(shí)這種可能性。本研究結(jié)果即EZH2介導(dǎo)的胃癌中核因子κB靶基因調(diào)控為闡明慢性炎癥促進(jìn)胃癌發(fā)生以及潛在的靶向治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Figure4.SilencingofEZpinhibitedTNF-α-mediatedNF-κBtranscriptionalactivityanddownstreamtargetgeneexpression.A: EZpsilencingdecreasedTNF-α-inducedNF-κB-LucandIL-8-Lucactivity;B: EZpsilencingsuppressedNF-κBtargetgeneexpressioninducedbyTNF-α.Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P<0.01vsscrambled ;##P<0.01vsscrambled + TNF-α.

圖4EZp沉默對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的核因子κB的轉(zhuǎn)錄活性及其靶基因的抑制作用

Figure5.Over-expressedEZH2physicallyintereactedwithNF-κBp65inHEK293Tcells.A:interactionbetweenHA-EZH2andV5-p65detectedbyimmunoprecipitionwithV5antibody;B:bindingofV5-p65toHA-EZH2byimmunoprecipitionwithHAantibody.

圖5過(guò)表達(dá)的EZH2與NF-κBp65的相互作用

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81370706；No. 81372758)；重慶市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.cstc2013jcyjA10058)；重慶市人力資源與社會(huì)保障局課題資助項(xiàng)目(渝留助2013011號(hào))；重慶市衛(wèi)生局課題資助項(xiàng)目(No. 2012-2-001)

EZp-mediated regulation of NF-κB target gene expression in gastric cancerWU Xue-lei1, CAI Yao-wu1, ZHUANG Zhi-zhong1, CHEN Yuan-jing1, GUO Ren-jie2, ZHENG Mao-song1

(1DepartmentofOncology,2DepartmentofPathology,TheFirstAffiliatedHospitalofPutianCity,PutianUniversity,Putian351100,China.E-mail:xuelei_wu@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To explore the mechanism by which over-expression of enhancer of zeste homolog 2 (EZp) in a panel of gastric cancer cell lines is involved in tumorigenesis of gastric cancer. METHODS: Real-time PCR and Western blot were employed to examine the mRNA and protein levels of EZp, respectively. MTS assay, cell migration and soft agar assay were performed to investigate the role of EZp in the regulation of stomach cancer behaviors. The effect of EZp on NF-κB target gene expression was determined by Luciferase reporter and real-time PCR. Co-immunoprecipitation was used to analyze the interaction of EZp and p65 in HEK293T cells. RESULTS: The expression levels of EZp were significantly increased in the gastric cancer cells compared with normal gastric epithelial cells. Pharmacological inhibition by DZNep or knockdown of EZH2 significantly compromised AGS and SNU-16 cell activity, cell migration and anchorage-independent cell growth. Moreover, siRNA knockdown of EZH2 impaired NF-κB downstream targets, such as IL-8, CXCL5 and CCL20. In addition, the interaction of EZp and p65 was detected. CONCLUSION: EZp mediates the growth of gastric cancer cells through the regulation of NF-κB downstream gene expression.

[KEY WORDS]Gastric cancer; Enhancer of zeste homolog 2; Nuclear factor-κB

通訊作者△Tel: 023-89012559; E-mail: gouxincq@163.com

[收稿日期]2015- 05- 07[修回日期] 2015- 09- 21

[文章編號(hào)]1000- 4718(2015)12- 2176- 07

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.010

[中圖分類(lèi)號(hào)]R730.23.12

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A