梁　心，桂雙英,2,3，王舉濤，彭代銀，陳培勝，金傳山,2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥　230012；2.安徽省中藥制劑工程技術(shù)研究中心，安徽 合肥　230012；

3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，安徽 合肥　230012；4.安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司，安徽 亳州　236800)

?

超高液相色譜法測(cè)定桔梗飲片和桔梗配方顆粒中桔梗皂苷D含量

梁心1，桂雙英1,2,3，王舉濤1，彭代銀1，陳培勝4，金傳山1,2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230012；2.安徽省中藥制劑工程技術(shù)研究中心，安徽 合肥230012；

3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，安徽 合肥230012；4.安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司，安徽 亳州236800)

[摘要]目的采用超高效液相色譜法建立桔梗飲片及桔梗配方顆粒中桔梗皂苷D的含量測(cè)量方法，為桔梗配方顆粒的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法采用Waters Acquity UPLC HSS T3柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)，以乙腈和水為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速 0.25 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫29 ℃。結(jié)果桔梗皂苷D進(jìn)樣量在0.504~2.520 μg范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為99.89%，RSD為1.64%；桔梗飲片和桔梗配方顆粒中桔梗皂苷D的含量具有差異。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)所建立的測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，可用于桔梗飲片和桔梗配方顆粒中桔梗皂苷D含量的檢測(cè)。

[關(guān)鍵詞]桔梗飲片；桔梗配方顆粒；桔梗皂苷D；超高效液相色譜法

桔梗為桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根[1]，具有宣肺、利咽、祛痰、排膿之功效。桔梗主產(chǎn)于安徽、山東及內(nèi)蒙古等地，安徽省作為桔梗的主產(chǎn)區(qū)，桔梗栽培面積較大，產(chǎn)量頗豐[2]。桔梗的主要活性成分為三萜皂苷，目前已分離得到45個(gè)三萜皂苷類化學(xué)成分，其中桔梗皂苷D是含量相對(duì)較高的一種皂苷，藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，桔梗皂苷D具有祛痰鎮(zhèn)咳、降脂降糖以及抗癌作用[3-5]。臨床配方有桔梗飲片和桔梗配方顆粒兩種使用形式。桔梗飲片由桔梗藥材炮制而成；桔梗配方顆粒是以桔梗飲片為原料，經(jīng)提取、濃縮、干燥、制粒而成。為有效控制桔梗飲片和配方顆粒質(zhì)量，本研究選取10批安徽產(chǎn)桔梗藥材，分別制成桔梗飲片和配方顆粒，首次采用超高效液相色譜法測(cè)定桔梗飲片及桔梗配方顆粒中桔梗皂苷D的含量，并對(duì)二者相關(guān)性進(jìn)行分析。

1儀器與材料

1.1儀器Waters Acquity超高效液相色譜儀H-class色譜系統(tǒng)，包括四元超高壓溶劑系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣恒溫樣品管理器、PDA檢測(cè)器、柱溫箱及Empower 2色譜工作站：美國(guó)Waters公司；AG285型十萬(wàn)分之一電子分析天平：德國(guó)賽多利斯公司；KQ2200型超聲儀：江蘇昆山超聲儀器有限公司；HFB-200型中藥粉碎機(jī)：湖南吉首市中州市中藥機(jī)械廠；DZF-6050型真空干燥箱：上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2材料10批桔梗藥材分別于2013年10月至2014年1月收集于安徽不同地區(qū)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)金傳山教授鑒定均為桔?？浦参锝酃latycodongrandiflorum(Jacq.)A. DC.干燥根，并委托安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司由同批藥材制得桔梗飲片、配方顆粒各10批(批號(hào)及藥材具體來(lái)源見(jiàn)表1)，桔梗飲片炮制方法按照《中華人民共和國(guó)藥典》(2010年版)炮制方法，桔梗配方顆粒以桔梗飲片為原料，經(jīng)水提取、濃縮、噴霧干燥制成的顆粒；桔梗皂苷D對(duì)照品(批號(hào) 13082211，購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，純度99.6%)；乙腈、甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純；屈臣氏蒸餾水；硅膠G板(青島海洋化工廠分廠)。

表1　桔梗藥材來(lái)源及飲片、配方顆粒批號(hào)

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件Waters Acquity 超高效液相色譜儀HSS T3柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫順序?yàn)椋?0~2 min，20% A；2~5 min，20% A；5~6 min，40% A；6~9 min，40% A；9~10 min，20% A)，流速：0.25 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫29 ℃，進(jìn)樣量：1 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱定桔梗皂苷D對(duì)照品5.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容到刻度，即得。

2.3供試品溶液的制備分別取干燥桔梗飲片粉末和桔梗配方顆粒(過(guò)2號(hào)篩)約2.0 g，精密稱定，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，置水浴上蒸干，殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解，加水飽和正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液50 mL洗滌，棄去氨液，再用正丁醇飽和的水50 mL洗滌，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過(guò)(0.22 μm)，即得。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系考察精密吸取桔梗皂苷D對(duì)照品溶液(0.504 mg/mL)1、2、3、4、5 μL，注入超高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定桔梗皂苷D峰面積，以色譜峰峰面積(y)為縱坐標(biāo)，以濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程：y=316 535.6x-45 859.6，r=0.999 95，表明桔梗皂苷D在0.504～2.520 μg范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.4.2精密度試驗(yàn)精密吸取桔梗皂苷D對(duì)照品溶液(0.504 mg/mL)1 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示，桔梗皂苷D峰面積值的RSD為1.10%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批次供試品溶液(批號(hào) 1310048-1)，分別于0、2、4、8、12、24 h，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示，桔梗皂苷D峰面積的RSD值為1.11%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.4.4重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次桔梗飲片(批號(hào) 1310048-1)，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備6份樣品溶液，依照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積并計(jì)算桔梗皂苷D含量。結(jié)果表明，批號(hào) 1310048-1的桔梗飲片中桔梗皂苷D的平均含量為2.434 mg/g，RSD為1.15%，說(shuō)明本法重復(fù)性良好。

2.4.5加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取已知含量同一批次的桔梗飲片(批號(hào) 1310048-1)粉末0.50 g，共6份，精密移取桔梗皂苷D對(duì)照品溶液(0.575 mg/L)2.0 mL加入到飲片粉末中，按“2.3”項(xiàng)下方法制備加樣回收供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，每次1 μL，測(cè)定色譜峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　桔梗皂苷D加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4.6樣品含量測(cè)定結(jié)果分別取10批桔梗飲片和配方顆粒，按照“2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件依法測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算桔梗皂苷含量，結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

表3　各批次飲片中桔梗皂苷D含量

表4　各批次配方顆粒中桔梗皂苷D含量

根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》(2010年版)一部“桔?！表?xiàng)下要求，桔梗飲片中桔梗皂苷D含量不得低于0.10%。因此，本次實(shí)驗(yàn)采用的10批桔梗飲片含量均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，根據(jù)對(duì)10批桔梗飲片及配方顆粒的樣品含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，同批飲片和配方顆粒的桔梗皂苷D含量，大部分批次樣品損失率在17%左右，少數(shù)批次可達(dá)到30%，桔梗配方顆粒能較好地保留飲片中有效成分桔梗皂苷D。此外，根據(jù)10批桔梗配方顆粒中桔梗皂苷D的含量實(shí)際測(cè)得值在1.076～2.114 mg/g，因此，桔梗配方顆粒每克含桔梗以桔梗皂苷D計(jì)，應(yīng)不少于0.86 mg。

3討論

3.1供試品溶液制備方法實(shí)驗(yàn)中供試品溶液制備時(shí)，曾嘗試采用超聲提取法制備樣品溶液，但得到的樣品溶液中雜質(zhì)較多，特征峰難以分離；然后參考《中華人民共和國(guó)藥典》(2010年版)“桔?！表?xiàng)下超聲提取、正丁醇萃取、硅膠柱分離的方法，結(jié)果樣品雜質(zhì)較少，但桔梗皂苷D損失較大。本課題組在實(shí)驗(yàn)中比較了直接萃取和萃取與硅膠柱分離結(jié)合兩種純化方式，結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)采用的色譜條件下，直接萃取桔梗皂苷D的色譜峰能夠很好的分離，且可避免柱分離過(guò)程中桔梗皂苷D損失，因此采用超聲提取、正丁醇萃取的制備方法。

3.2色譜條件目前文獻(xiàn)已報(bào)道的對(duì)桔梗藥材中桔梗皂苷D的測(cè)定方法有高效液相色譜-紫外檢測(cè)器法[6-8]和高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法[9-10]。超高效液相色譜法是一種基于小顆粒填料的液相色譜技術(shù)，其理論基礎(chǔ)為范德米特方程，通過(guò)降低顆粒度提高柱效和速度，可彌補(bǔ)傳統(tǒng)高效液相系統(tǒng)的不足[11]。本實(shí)驗(yàn)采取的超高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定，其譜峰的保留時(shí)間均在10 min以內(nèi)，極大地縮短了分析時(shí)間，同時(shí)超高效液相色譜法的流速僅為0.25 μL/min，進(jìn)樣體積為1 μL，而高效液相色譜法流速多在0.7 mL/min，進(jìn)樣量在10 μL或以上，因此采取超高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定可大大降低分析成本。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，其還具有靈敏度高、重復(fù)性好、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。

在流動(dòng)相考察中，曾試用純乙腈、乙腈-水(75∶25)、純甲醇、甲醇-水(70∶30)，但分離效果均不理想，出現(xiàn)洗脫較快、特征峰無(wú)法有效分離等問(wèn)題，故采取梯度洗脫法進(jìn)行分析，桔梗皂苷D分離效果良好。

參考文獻(xiàn):

[1]國(guó)家藥典編委會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:259-260.

[2]張玲,王德群.安徽省桔?？扑幱弥参镔Y源調(diào)查[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2003,22(6):48-50.

[3]Shin CY, Lee WJ, Lee EB, et al. Platycodin D and D3 increase airway mucin releaseinvivoandinvitroin rats and hamsters [J]. Planta Med, 2002, 68(3): 221-225.

[4]Lee EJ, Kang M, Kim YS, et al. Platycodin D inhibits lipogenesis through AMPKα-PPARγ in 3T3-L1 cells and modulates fat accumulation in obese mice[J]. Planta Med,2012,78(14):1536-1542.

[5]Chun J, Joo EJ, Kang M, et al. Platycodin D induces anoikis and caspase-mediated apoptosis via p38 MAPK in AGS human gastric cancer cells[J]. J Cell Biochem,2013,114(2):456-470.

[6]李喜鳳,杜云鋒,謝新年,等.不同產(chǎn)地桔梗藥材HPLC指紋圖譜及桔梗皂苷D含量測(cè)定研究[J].中成藥,2010,32(4):529-532.

[7]李偉,王梓,劉志,等.RP-HPLC同時(shí)測(cè)定桔梗中去芹糖桔梗皂苷D與桔梗皂苷D[J].中草藥,2009,40(11):1823-1825.

[8]金傳山,張偉,桂雙英,等.不同產(chǎn)地桔梗中桔梗皂苷D及總多糖的含量比較[J].安徽醫(yī)藥,2014,18(2):246-249.

[9]李紅燕,張蕊,馮曉川,等.HPLC-ELSD法測(cè)定復(fù)方枇杷止咳顆粒中桔梗皂苷D、熊果酸、齊墩果酸和貝母素甲[J].中成藥,2013,35(7):1479-1484.

[10]丁大勇,高菲,姚琳,等.HPLC-ELSD法測(cè)定桑菊感冒片中桔梗皂苷D的含量[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2012,19(3):54-55.

[11]陳佳,王鋼力,姚令文,等.超高效液相色譜(UPLC)在藥物分析領(lǐng)域的應(yīng)用[J].藥物分析雜志,2008,28(11)：1976-1981.

Determination of Platycodin-D inPlatycodongrandiflorumDecoction Piece and Its Formula Granule by Ultra-Performance Liquid Chromatography

LIANGXin1,GUIShuang-ying1,2,3,WANGJu-tao1,PENGDai-yin1,CHENPei-sheng4,JINChuan-shan1,2

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.AnhuiEngineeringResearchCenterforChineseMedicinePreparation,AnhuiHefei230012,China; 3.InstituteofPharmaceutics,AnhuiAcademyofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 4.AnhuiJirenPharmaceuticalCo.,Ltd.,AnhuiBozhou236800,China)

[Abstract]ObjectiveTo develop a method for determination of the content of platycodin-D in Platycodon grandiflorum Decoction Piece and its Formula Granule by ultra-performance liquid chromatography (UPLC), and to provide experimental evidence for the quality control of Platycodon grandiflorum Formula Granule. MethodsThe Waters Acquity UPLC HSS T3 column (2.1 mm × 50 mm, 1.8 μm) was used with a mobile phase of acetonitrile and water. The elution was performed in a gradient mode at a flow rate of 0.25 mL/min. The detection wavelength was 210 nm and the column temperature was 29 ℃. ResultsA good linear relationship with peak area was achieved when the amount of injected platycodin-D ranged between 0.504 and 2.520 μg. The recovery of the sample averaged 99.89% and the relative standard deviation was 1.64%. The content of platycodin-D varied between Platycodon grandiflorum Decoction Piece and its Formula Granule. ConclusionThis study establishes an easy, accurate, and reliable approach for determination of the content of platycodin-D in Platycodon grandiflorum and its Formula Granule.

[Key words]Platycodon grandiflorum Decoction Piece; Platycodon grandiflorum Formula Granule; platycodin-D; ultra-performance liquid chromatography

收稿日期：(2015-04-13；編輯：張倩)

通信作者：桂雙英，guishy0520@126.com

作者簡(jiǎn)介：梁心(1990-)，女，碩士研究生

基金項(xiàng)目：科技部十二五科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAI04B06)；安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目(12010402084)

[中圖分類號(hào)]R927.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.06.025