梁益敏，郁　陽，麻兵繼，王國(guó)凱，劉勁松，李守婷，王　剛

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院　現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥　230012；

2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州　450002)

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一種人工栽培霍山石斛內(nèi)生真菌的分離鑒定及其組織分布

梁益敏1，郁陽1，麻兵繼2，王國(guó)凱1，劉勁松1，李守婷2，王剛1

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230012；

2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州450002)

[摘要]目的對(duì)霍山石斛內(nèi)生真菌進(jìn)行分離鑒定，為揭示霍山石斛與內(nèi)生真菌的共生關(guān)系提供依據(jù)。 方法運(yùn)用組織分離法對(duì)栽培霍山石斛內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的手段對(duì)其進(jìn)行鑒定。 結(jié)果從霍山石斛中分離得到12株內(nèi)生真菌，鑒定為6屬12種，分別為Fusarium guttiforme、Phyllosticta aristolochiicola、Stagonosporopsis crystalliniformis、Aspergillus tubingensis、Aspergillus flavus、Colletotrichum orchidophilum、Acrocalymma aquatica、Fusarium keratoplasticum、Fusarium bactridioides、Aspergillus ochraceus、Fusarium pseudensiforme、Colletotrichum brisbanense。結(jié)論霍山石斛中內(nèi)生真菌種類豐富，且在不同組織中分布存在差異性。

[關(guān)鍵詞]霍山石斛；內(nèi)生真菌；分離；鑒定

石斛藥材是蘭科(Orchidaceae)植物石斛屬(Dendrobium)多種植物新鮮或干燥莖的統(tǒng)稱，為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，在民間有“九大仙草之首”的稱譽(yù)。石斛在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，具有益胃生津、滋陰清熱、明目利嗓、鎮(zhèn)痛消炎等功效[1-2]?；羯绞?Dendrobiumhuoshanense)又稱米斛，為石斛藥材的一種，莖直立，肉質(zhì)，不分枝，具3～7節(jié)，淡黃綠色，有時(shí)帶淡紫紅色斑點(diǎn)，葉革質(zhì)，舌狀長(zhǎng)圓形，主產(chǎn)于大別山區(qū)的安徽省霍山縣[3]，為安徽道地藥材。

植物內(nèi)生真菌是指其生活史中某一階段或整個(gè)階段生活在生長(zhǎng)健康的植物組織或細(xì)胞內(nèi)，并對(duì)宿主植物沒有明顯病害癥狀的一類真菌[4]。研究[5]表明，植物內(nèi)生真菌與其宿主植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中存在互生互惠的關(guān)系，能產(chǎn)生與宿主植物相同或者相似的化學(xué)成分，且不同生態(tài)環(huán)境下道地藥材和非道地藥材內(nèi)生真菌的種群結(jié)構(gòu)和功能具有差異性。因此，對(duì)藥用植物內(nèi)生真菌的研究，可以揭示內(nèi)生真菌與其植物宿主之間的共生關(guān)系，了解內(nèi)生真菌對(duì)道地藥材的形成機(jī)制，有利于瀕危藥用植物資源的保護(hù)與持續(xù)利用。近年來，霍山石斛由于生長(zhǎng)環(huán)境特殊，種子繁殖率低以及人為無限制的采挖等原因，導(dǎo)致自然資源嚴(yán)重匱乏，甚至瀕臨滅絕。因此，加強(qiáng)對(duì)霍山石斛屬藥材內(nèi)生真菌的研究，探索霍山石斛藥材資源的可持續(xù)利用十分緊迫。

目前相關(guān)學(xué)者對(duì)霍山石斛藥材內(nèi)生真菌報(bào)道較少，僅有王娣等[6]從中分離得到1株內(nèi)生真菌，僅對(duì)宿主株高有一定的促生長(zhǎng)作用，而對(duì)鮮重和分蘗的促進(jìn)作用不明顯，筆者認(rèn)為可能對(duì)其內(nèi)生真菌分離株數(shù)較少，沒有相應(yīng)的菌株資源而篩選不出合適的促生菌，因此，本研究分離鑒定霍山石斛的內(nèi)生真菌，探索霍山石斛藥材內(nèi)生真菌的多樣性，為今后系統(tǒng)地研究?jī)?nèi)生真菌與霍山石斛藥材品質(zhì)之間的相關(guān)性提供思路。

1材料

1.1供試樣品栽培霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)健康植株于2015年6月17號(hào)采自安徽省六安市霍山縣長(zhǎng)沖中藥材開發(fā)有限公司石斛生產(chǎn)基地，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)方成武教授鑒定為蘭科石斛屬霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)。

1.2分離純化培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)不含抗生素，由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.3儀器與試劑LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；JJ-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)：吳江市凈化設(shè)備總廠；SHP-250型生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MIKRO 22R高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Hettick公司；T-Gradient Thermoblock PCR儀：德國(guó)Biometra公司；G-BOX凝膠成像系統(tǒng)Gene Snap：英國(guó)Syngene公司；DYY-8C電泳儀：北京六一儀器廠；植物/真菌基因組DNA小量提取試劑盒：上海萊楓生物科技有限公司。通用引物為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacers, ITS)1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，均由上海生工生物工程股份有限公司定制。

2方法

2.1內(nèi)生真菌的分離和純化分別取健康無病害栽培霍山石斛完整植株，用自來水沖洗干凈，去其須根和腐葉，無菌濾紙吸干表面水分，按照常規(guī)表面消毒法：依次用75%乙醇浸泡1~2 min，3%次氯酸鈉浸泡3 min，75%乙醇清洗30 s，最后用無菌水沖洗5次。用無菌濾紙吸干表面多余的水分，取最后一次無菌水200 μL涂布于PDA培養(yǎng)基中，平行3份，作為空白對(duì)照。倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃避光培養(yǎng)3~5 d，要求對(duì)照平板無菌落生成，確保表面滅菌徹底。取表面消毒后的植株，用滅菌刀片將植株的根、莖切成0.2 cm的小段；用無菌剪刀將葉剪成0.1 cm×0.1 cm的小塊，接于PDA培養(yǎng)基中，每個(gè)平板接3~5塊，平行3份，倒置在恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃避光培養(yǎng)5~15 d。每日觀察平板中內(nèi)生真菌的菌落形態(tài)特征，將切口處新長(zhǎng)出的菌絲用無菌牙簽挑取，并置于新的PDA培養(yǎng)基中，按上述培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)2~3代，確保所得菌為純菌。

參考文獻(xiàn)2.2內(nèi)生真菌形態(tài)學(xué)鑒定方法[7]，根據(jù)所分得的真菌菌落培養(yǎng)特征、菌絲形態(tài)，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)類型以及孢子的形態(tài)、顏色、大小進(jìn)行初步鑒定分類。

2.3內(nèi)生真菌分子鑒定

2.3.1內(nèi)生真菌DNA提取將純化好的菌株接種于PDA平板上，28 ℃避光培養(yǎng)5~7 d。待平板上長(zhǎng)滿菌絲后，用滅菌的刮刀刮取菌絲體于滅菌的研缽中。參照真菌基因組DNA小量提取試劑盒步驟進(jìn)行操作得到DNA溶液，置于-20 ℃冰箱中保存、備用。

2.3.2rDNA-ITS的PCR擴(kuò)增擴(kuò)增真菌rDNA-ITS序列引物為：上游引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；下游引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應(yīng)體系50 μL，其中內(nèi)切酶(Premix Tap)25 μL，ITS1(20 μmol/L)2 μL，ITS4(20 μmol/L)2 μL，雙蒸水19 μL，DNA模板2 μL。

PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性95 ℃，5 min，變性95 ℃，1 min，復(fù)性49 ℃，1 mim，延伸72 ℃，2 min，30個(gè)循環(huán)，最后延伸72 ℃，10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，1×三羥甲基氨基甲烷-乙酸(tris(hydroxymethyl)aminomethane-acetic acid, TAE)電泳緩沖液，以100 V電壓電泳約40 min，溴化乙錠(ethidium bromide, EB)染色5 min，由凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察，拍照。檢測(cè)后置于-20 ℃冰箱中保存、備用。

2.3.3內(nèi)生真菌rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行比對(duì)分析，采用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。其中系統(tǒng)進(jìn)化矩陣按Kimura 2參數(shù)模型估算，采用鄰接法聚類分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)取樣1 000次進(jìn)行自展值分析評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，再結(jié)合序列對(duì)比，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。

3結(jié)果

3.1內(nèi)生真菌分離通過組織分離法從霍山石斛中分離得到12株，其中從根、葉中分別分離得到3株，從莖中分離得到6株。

3.2形態(tài)學(xué)鑒定分離得到的內(nèi)生真菌通過菌落特征和顯微觀察，菌株HSSH01、HSSP08、HSSH09、HSSH11表面菌絲相對(duì)茂密，白色，棉絮狀，有大量分生孢子，鍥形至梭狀鐮刀形，隔膜明顯，多3個(gè)隔膜，間有4~6個(gè)隔膜，7 d之后菌絲逐漸成褐黃色，如HSSH08和HSSH11；顯微下菌絲大多粗壯，呈規(guī)則或不規(guī)則樹枝狀分布，后期菌絲顏色逐漸變深，孢子散落在菌絲中。菌株HSSH02表面分生孢子器球形，扁球形，周圍壁明顯加厚，色深，器壁較薄，多為膜質(zhì)，黃褐色至深褐色，呈扇形分布，不易散落，顯微中孢子局部聚集，淺綠色，菌絲粗壯，無規(guī)則交叉分布。菌株HSSH04、HSSH05、HSSH10表面分生孢子球形、近球形、橢圓形或梨形，淡黃色或者黃色，易散落，顯微中孢子褐綠色，不規(guī)則聚集狀分布。菌株HSSH3、HSSH6、HSSH7、HSSH12因不產(chǎn)孢子，形態(tài)和顯微鑒定沒有意義，故只能通過分子生物學(xué)鑒定。按照魏景超[7]編著的《真菌鑒定手冊(cè)》(第一版)初步認(rèn)為菌株HSSH01、HSSH08、HSSH09和HSSH11為鐮刀菌屬(Fusarium)真菌；菌株HSSH02為葉點(diǎn)霉屬(Phyllosticta)屬；菌株HSSH04、HSSH05、HSSH10為曲霉屬(Aspergillus)。結(jié)果見圖1。

3.3分子學(xué)鑒定

3.3.1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果對(duì)分離得到的內(nèi)生真菌提取DNA，得到DNA提取液，進(jìn)行rDNA-ITS序列擴(kuò)增，在550 bp左右處出現(xiàn)一條單一明亮的條帶，內(nèi)生真菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。

3.3.2rDNA-ITS序列比對(duì)以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建登陸美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov)，將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對(duì)分析，具體結(jié)果見表1。

表1　內(nèi)生真菌分子鑒定序列比對(duì)表

對(duì)比分離得到的12株內(nèi)生真菌與其同源性相似的12株已知菌種的16S DNA序列，利用MEGA 5.0和Clustal X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

由表1和圖3可知，霍山石斛的內(nèi)生真菌分布在6個(gè)屬中，其種類資源廣泛。從霍山石斛中分離得到的內(nèi)生真菌主要分布在Fusarium和Aspergillus屬中，占其總數(shù)的58.3%，為其優(yōu)勢(shì)種群；另外，在霍山石斛中分離得到的Stagonosporopsis、Phyllosticta和Acrocalymma屬真菌在其他石斛屬藥材中未發(fā)現(xiàn)，拓展了石斛屬內(nèi)生真菌的種類資源。

4討論

近年來，由于野生的霍山石斛現(xiàn)在已經(jīng)很難再發(fā)現(xiàn)，且關(guān)于栽培霍山內(nèi)生真菌文獻(xiàn)研究報(bào)道更是寥寥無幾。本實(shí)驗(yàn)對(duì)所采集的栽培霍山石斛內(nèi)生真菌進(jìn)行分離鑒定，共分離得到12株菌種，所分離鑒定的菌株絕大多數(shù)已發(fā)現(xiàn)在其他石斛中[2,8-10]，如Fusarium、Aspergillus和Colletotrichum屬，這也是上述霍山石斛的優(yōu)勢(shì)菌種。其他屬內(nèi)生真菌如Stagonosporopsi、Phyllosticta等還沒有在相關(guān)石斛內(nèi)生真菌文獻(xiàn)上報(bào)道過，且莖中的內(nèi)生真菌的豐富度大于根和葉中，本研究結(jié)果豐富了石斛屬內(nèi)生真菌的種類和資源，填補(bǔ)了霍山石斛內(nèi)生真菌研究的空白。

內(nèi)生真菌在與植物協(xié)同進(jìn)化的過程中，不僅可以增強(qiáng)藥用植物的生物學(xué)特性，如促生長(zhǎng)，增加抗逆性，還可以促進(jìn)藥用植物的有效成分的合成和積累，陳貝貝等[11]從地黃中分離得到一株Ceratobasidium屬內(nèi)生真菌，該菌能顯著促進(jìn)無菌苗出根，提高盆栽苗的根冠比，顯著提高葉片中葉綠素含量，從而提高植物的光合作用能力，增強(qiáng)植物的生長(zhǎng)力。馬云桐等[12]從不同產(chǎn)地的虎杖中分離得到164株內(nèi)生真菌，盤多毛孢菌屬、芽孢菌屬真菌可促進(jìn)虎杖中大黃素的合成與積累，而虎杖苷的形成與積累受擬青霉菌屬、青霉菌屬、盤多毛菌屬、地霉菌屬真菌的影響。徐文婷等[13]選用草炭土、菇渣、玉米芯等3種基質(zhì)與內(nèi)生真菌Chs-1-1、R2、S3制備菌劑進(jìn)行鐵皮石斛田間試驗(yàn)，結(jié)果表明接種處理后鐵皮石斛幼苗的存活率顯著高于對(duì)照品，最高者達(dá)95.78%，接種菌劑能有效提高幼苗的株高和根系生長(zhǎng)，株高增幅為7.6%～59.2%，根總長(zhǎng)增幅為19.39%～88.1%，葉綠素a、葉綠素b的含量，植株N、P、K的含量均顯著高于對(duì)照品，鎂、鐵、鋅、錳、鉻5種微量元素的含量也均高于對(duì)照品。因此，通過研究道地藥材內(nèi)生真菌的種群結(jié)構(gòu)，并分析其對(duì)藥材性狀，產(chǎn)量以及有效成分所產(chǎn)生的影響，有利于揭示內(nèi)生真菌與道地藥材的相關(guān)性[13]。因此，本研究分離鑒定霍山石斛的內(nèi)生真菌，豐富了石斛屬植物內(nèi)生真菌的種類資源，為今后進(jìn)一步揭示內(nèi)生真菌與霍山石斛藥材之間的相關(guān)性，如促生長(zhǎng)，增加抗逆性，有效成分的合成和積累等以及合理開發(fā)霍山石斛藥材資源提供前期研究基礎(chǔ)，將有利于今后實(shí)現(xiàn)道地霍山石斛的高效、規(guī)?；斯ぴ耘嗉百|(zhì)量控制。

注：M.marker；1.HSSH01；2.HSSH02；3.HSSH03；4.HSSH04；5.HSSH05；6.HSSH06；7.HSSH07；8.HSSH08；9.HSSH09；10.HSSH10；11.HSSH11；12.HSSH12。

鑒于中藥石斛目前是我國(guó)珍稀瀕危的藥材品種，因此，積極研究其內(nèi)生真菌的生態(tài)狀況，對(duì)揭示環(huán)境條件對(duì)藥材道地性形成的重要影響及資源的有效利用與開發(fā)，都有著重大意義。

[1]張禧慶.藥用石斛內(nèi)生真菌的分離鑒定及活性成分初步研究[D].貴陽：貴州大學(xué)，2008:6-7.

[2]張麗春,郭順星.5種石斛內(nèi)生真菌的分離及其抗菌活性研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2009,44(20):1540-1542.

[3]張煒玲,王新生,戴亞峰,等.霍山石斛最新研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(36):20661-20663.

[4]陳龍,梁子寧,朱華.植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào),2015,31(8):30-33.

[5]徐范范,金波,丁志山.藥用植物內(nèi)生真菌產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展[J].醫(yī)藥綜述,2010,16(17):2667-2668.

[6]王娣,賈書華,張兆軒,等.霍山石斛內(nèi)生真菌分離、培養(yǎng)及其促生作用的初步研究[J].菌物研究,2007,5(2):85-88.

[7]魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)技術(shù)出版社,1979:321-378.

[8]方香香,張壽文.鐵皮石斛內(nèi)生真菌研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥,2014,16(5):419-422.

[9]張延威,康冀川.石斛內(nèi)生真菌的研究概述[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào),2005,24(5):438-439.

[10]洪群艷,董文漢,徐文婷,等.幾種云南野生石斛內(nèi)生真菌的鑒定及分布[J].生物技術(shù)進(jìn)展,2012,2(3):190-194.

[11]陳貝貝,王敏,胡鳶雷,等.地黃內(nèi)生真菌促生作用的初步研究[J].中國(guó)中藥雜志,2011,36(9):1137-1140.

[12]馬云桐,萬德光,嚴(yán)鑄云,等.虎杖內(nèi)生真菌與有效成分的相關(guān)性研究[J].華西藥學(xué)雜志,2009,24(5):464-466.

[13]徐文婷,張雅瓊,董文漢,等.石斛內(nèi)生真菌固體菌劑對(duì)鐵皮石斛組培苗促生作用研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2014,27(1):317-324.

[14]江曙,錢大瑋,段金廒.等.植物內(nèi)生菌與道地藥材的相關(guān)性研究[J].中草藥,2008,39(8):1268-1271.

·方藥研究·

Isolation, Identification, and Tissue Distribution of Endophytic Fungi in CultivatedDendrobiumhuoshanense

LIANGYi-min1,YUYang1,MABing-ji2,WANGGuo-kai1,LIUJing-song1,LIShou-ting2,WANGGang1

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine&AnhuiKeyLaboratoryofModernChineseMateriaMedica,AnhuiHefei230012,China; 2.CollegeofAgronomy,HenanAgriculturalUniversity,HenanZhengzhou450002,China)

[Abstract]ObjectiveTo isolate and identify endophytic fungi from Dendrobium huoshanense, and to provide a basis for investigating the symbiotic relationship between Dendrobium huoshanense and endophytic fungi. MethodsTissue isolation was applied to isolate endophytic fungi from cultivated Dendrobium huoshanense, and morphology and molecular biology were used to identify these fungi. ResultsA total of 12 strains of endophytic fungi were isolated from Dendrobium huoshanense and identified as 12 species in 6 genera. These fungi were Fusarium guttiforme, Phyllosticta aristolochiicola, Stagonosporopsis crystalliniformis, Aspergillus tubingensis, Aspergillus flavus, Colletotrichum orchidophilum, Acrocalymma aquatica, Fusarium keratoplasticum, Fusarium bactridioides, Aspergillus ochraceus, Fusarium pseudensiforme, and Colletotrichum brisbanense. ConclusionThere are rich species of endophytic fungi in Dendrobium huoshanense, with different distributions in various tissues.

[Key words]Dendrobium huoshanense; endophytic fungi; isolation; identification

收稿日期：(2015-10-09；編輯：姚實(shí)林)

通信作者：王剛，kunhong8@163.com

作者簡(jiǎn)介：梁益敏(1961-)，女，副教授

[中圖分類號(hào)]R931.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.06.024