王冰+杜錦+向春陽(yáng)+王松文+曹高燚

摘 ? ?要：5-磷酸烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）是除草劑草甘膦的靶標(biāo)酶，轉(zhuǎn)基因抗草甘磷作物主要通過(guò)轉(zhuǎn)入外源EPSPS編碼基因或者對(duì)外源EPSPS定點(diǎn)突變來(lái)獲得。為了擴(kuò)充草甘膦抗性基因資源，篩選新型草甘膦抗性基因，本研究分離篩選并獲得了一株新型草甘膦抗性菌株，16srDNA鑒定顯示該菌株屬于假單胞菌，該菌株被命名為假單胞菌818。該菌株的獲得為進(jìn)一步篩選克隆草甘膦抗性相關(guān)基因提供了可靠保障，豐富了草甘膦抗性基因資源庫(kù)，獲得自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型草甘膦抗性基因有利于應(yīng)對(duì)國(guó)外生物技術(shù)公司對(duì)該領(lǐng)域的壟斷，有利于我國(guó)遺傳改良作物的培育。

關(guān)鍵詞：5-磷酸烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶;草甘膦;假單胞菌;抗草甘膦作物

中圖分類號(hào)：S482.4 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.01.007

Screening and Identification of Glyphosate-Resistant Strain Pseudomonas818

WANG Bing，DU Jin， XIANG Chunyang， WANG Songwen， CAO Gaoyi

（College of Agronomy and Resources and Environment， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China）

Abstract： 5-phosphoenolpyruvate shikimic acid acyl-3-phosphate synthase （EPSPS） is the target enzyme of glyphosate. Over expressed exogenous EPSPS gene or site-directed mutagenesis of endogenous EPSPS are the major strategies to gain glyphosate resistant crops. In order to expand the glyphosate resistance gene resources， the glyphosate polluted soil was screened for identifying new glyphosate tolerant microbes. A novel glyphsoate resistant strain was separated which was named as Pseudomonas818 after the amplification of 16 s ribosome DNA. The strain will provide some useful information for cloning glyphosate resistant gene. The research could supplement the bank of glyphosate resistant genes and get rid of the restriction of foreign biotechnology companies. All in all， the novel discovery could provide some useful signals for crop genetic improvement.

Key words： 5-phosphoenolpyruvate shikimic acid acyl-3-phosphate synthase （EPSPS）;glyphosate;Pseudomonas;glyphosate-resistant crops

草甘膦（Glyphosate）作為一種重要的除草劑，具有高效、低毒、在環(huán)境中降解快、廣譜滅生等優(yōu)良特性，且制備工藝簡(jiǎn)單。草甘膦因其種種突出的特性，使其在幾十年間得以迅速發(fā)展，并成為當(dāng)今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中生產(chǎn)量及銷量最大、使用面積最廣的一種除草劑。草甘膦的作用機(jī)理主要是競(jìng)爭(zhēng)性地抑制莽草酸途徑中的催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和三磷酸莽草酸（S3P）生成5-磷酸烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸（EPSP）的5-磷酸烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS），通過(guò)占據(jù)EPSPS與底物結(jié)合的活性位點(diǎn)導(dǎo)致莽草酸途徑的受阻，進(jìn)而使植物體內(nèi)莽草酸大量積累，最終使植物產(chǎn)生草甘膦毒害[1]。EPSPS由aroA基因編碼，主要分為I型、II型及III型等3類。I型EPSPS主要來(lái)源于植物、大腸桿菌（Escherichia coli）及部分微生物，一般對(duì)草甘膦敏感，不具有草甘膦抗性;II型EPSPS主要來(lái)源于農(nóng)桿菌（Agrobacterium）、假單胞菌（Pseudomonas）等一些可以耐受極端環(huán)境的菌株，一般對(duì)草甘膦具有耐受性;III型EPSPS由于其結(jié)構(gòu)上的特異性將其單獨(dú)列出，此類EPSPS數(shù)量較少。

生物體為了解除草甘膦的脅迫作用，主要通過(guò)4種途徑來(lái)獲得草甘膦抗性：（1）過(guò)量表達(dá)EPSPS獲得草甘膦抗性;（2）定向進(jìn)化EPSPS，降低對(duì)草甘膦的敏感而獲得草甘膦抗性;（3）降解草甘膦;（4）通過(guò)非靶向性的調(diào)控作用獲得草甘膦抗性[2]。這4種途徑也是利用現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)培育抗草甘膦作物的主要策略。

在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，生物技術(shù)所占比重越來(lái)越大，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物在國(guó)內(nèi)外得到了飛速的發(fā)展，然而困擾抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展有一個(gè)重要因素就是稀缺的基因資源。當(dāng)前廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物生產(chǎn)的草甘膦抗性基因，主要是來(lái)源于Agrobacterium的CP4及來(lái)源于E.coli等I型EPSPS的TIPS突變體（第97位的Thr突變?yōu)镮le，第101位的Pro突變?yōu)镾er）[3-4]，以及由先鋒公司開(kāi)發(fā)的草甘膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因GAT[5]。我國(guó)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的發(fā)展與國(guó)外相比存在不小的差異，其中一個(gè)重要的原因就是緊缺的基因資源或者是少數(shù)性狀優(yōu)良的基因資源由于專利因素被國(guó)外公司牢牢把控?；诖?，應(yīng)該擴(kuò)寬草甘膦抗性基因的來(lái)源，獲取新型的草甘膦抗性基因，推動(dòng)我國(guó)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展。本研究通過(guò)逐步稀釋法篩選草甘膦污染土壤微生物，分離獲得一株新型草甘膦抗性菌株假單胞菌818。新的草甘膦抗性菌株的篩選鑒定，為下一步克隆草甘膦抗性基因奠定了基礎(chǔ)。