馬金梅，遲　良，鄒　明，劉煥奇

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島　266109；2.棲霞市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東棲霞　265300）

奶牛隱性乳房炎診斷技術(shù)研究進(jìn)展

馬金梅1，2，遲良1，鄒明1，劉煥奇1

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島266109；2.棲霞市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東棲霞265300）

目前，奶牛隱性乳房炎已成為奶牛常見的多發(fā)病，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重危害和巨大經(jīng)濟(jì)損失。本文對(duì)當(dāng)前該病的主要診斷技術(shù)與方法，包括體細(xì)胞計(jì)數(shù)法、乳汁PH檢驗(yàn)法、乳汁電導(dǎo)率檢測(cè)法、乳汁細(xì)菌培養(yǎng)、PCR檢測(cè)方法、MTT檢測(cè)法等，進(jìn)行了對(duì)比闡述，以期為選擇和研究奶牛隱性乳房炎相關(guān)診斷方法提供借鑒。

奶牛隱性乳房炎；診斷技術(shù)；細(xì)胞計(jì)數(shù)法；乳汁PH檢驗(yàn)法；乳汁電導(dǎo)率檢測(cè)法；乳汁細(xì)菌培養(yǎng)；PCR檢測(cè)方法；MTT檢測(cè)法

奶牛隱性乳房炎是奶牛的一種常見性、多發(fā)性疾病，具有發(fā)病率高、傳染性強(qiáng)、危害性大等特點(diǎn)，可直接造成產(chǎn)乳量減少、牛乳廢棄、牛乳價(jià)值降低等后果。奶牛隱性乳房炎無明顯的臨床癥狀，常被養(yǎng)殖戶忽視，導(dǎo)致治療不及時(shí)進(jìn)而發(fā)展成臨床型乳房炎，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重危害和經(jīng)濟(jì)損失。由于奶牛隱性乳房炎無明顯臨床癥狀，對(duì)該病的診斷需借助實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，目前主要診斷方法有以下幾種。

1　體細(xì)胞計(jì)數(shù)法

體細(xì)胞計(jì)數(shù)（SCC）是指計(jì)算每毫升乳汁中含有的體細(xì)胞數(shù)量［1］。乳汁中的體細(xì)胞主要包括乳腺分泌組織中的上皮細(xì)胞和炎性刺激產(chǎn)生的白細(xì)胞。當(dāng)奶?；既橄傺缀螅准?xì)胞數(shù)量增多，加之部分上皮細(xì)胞受損脫落，從而使體細(xì)胞數(shù)量增多。因此，根據(jù)乳汁中體細(xì)胞數(shù)的變化來判斷奶牛是否患有乳房炎，是診斷奶牛隱性乳房炎的一種較為簡(jiǎn)便、可靠的辦法。常用的方法有體細(xì)胞直接計(jì)數(shù)法和間接計(jì)數(shù)法。

1.1 體細(xì)胞直接計(jì)數(shù)法

一般采用專門的熒光顯微自動(dòng)測(cè)定儀來檢測(cè)。Little和Plas-trige發(fā)明了直接顯微鏡計(jì)數(shù)法（DMSCC），認(rèn)為每毫升乳汁體細(xì)胞數(shù)超過50萬即可認(rèn)為是乳房炎［2］，但目前對(duì)此結(jié)果的判定有所爭(zhēng)議。

1.2 體細(xì)胞間接計(jì)數(shù)法

1.2.1 加州乳房炎測(cè)試法（CMT）。其原理是牛奶中的體細(xì)胞在氫氧化鈉、烷基芳基磺酸等表面活性物質(zhì)和堿性藥物作用下，乳中體細(xì)胞被破壞，釋放出DNA進(jìn)一步作用，使乳汁產(chǎn)生沉淀或形成凝膠。體細(xì)胞數(shù)越多，產(chǎn)生的沉淀或凝膠就越多，可由此間接診斷炎癥的程度。這種方法是國(guó)際通用的隱性乳房炎診斷方法。由此原理還衍生了很多類似的檢測(cè)方法，如美國(guó)的威斯康星乳腺炎檢測(cè)法（WMT）、日本的PL法、北京的BMT法等。其特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、快速、敏感，環(huán)境溫度對(duì)其影響小，適用于大范圍推廣，不足之處在于它只是體細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量，判斷結(jié)果的準(zhǔn)確性需依靠檢測(cè)者的經(jīng)驗(yàn)而定，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽性。

1.2.2 DNA含量測(cè)定法。此方法依據(jù)的原理是牛奶中的體細(xì)胞被破壞后，其釋放的DNA含量與體細(xì)胞數(shù)呈正比，Urbanova等［3］通過研究證實(shí)了這一點(diǎn)。然后采用分光光度計(jì)測(cè)定得到DNA的量，轉(zhuǎn)化成體細(xì)胞數(shù)。DNA含量測(cè)定法比CMT、WMT具有更高的精度，然而，由于DNA分離太過繁瑣，且DNA的精確含量本身就帶有很大的誤差，難以在奶場(chǎng)或牛奶加工現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模應(yīng)用。

1.2.3 ATP法。作用機(jī)理是體細(xì)胞內(nèi)的ATP在熒光素酶的作用下，與熒光素結(jié)合產(chǎn)生的熒光和ATP濃度成正比，因此可以通過測(cè)定熒光的強(qiáng)度來測(cè)定ATP的濃度，從而間接測(cè)定牛奶中體細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 黏度法。作用原理是利用活性試劑促使體細(xì)胞釋放出的DNA和組蛋白跟牛奶形成膠狀混合物質(zhì)，從而使牛奶黏度增加。體細(xì)胞越多，則釋放的DNA越多，牛奶的黏度也越高，通過黏度值可測(cè)算其體細(xì)胞數(shù)。由于此方法對(duì)樣品的前期處理比較繁瑣，不利于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用，一般在實(shí)驗(yàn)室操作。

1.2.5 紅外熱成像法（IRT）。紅外熱成像技術(shù)是一項(xiàng)前途廣闊的高新技術(shù)。嚴(yán)建軍等［4］在牛奶體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)的研究進(jìn)展中提到，受感染的奶牛乳房表面溫度與牛奶體細(xì)胞數(shù)存在著一定的正相關(guān)關(guān)系，因此可以估算出牛奶體細(xì)胞數(shù)，從而檢測(cè)是否患有乳房炎。此方法對(duì)隱性乳房炎的檢測(cè)準(zhǔn)確度較高，但所檢測(cè)的表面溫度與體細(xì)胞數(shù)的正相關(guān)性一般以估算為主，存在誤差。

1.2.6 介電常數(shù)法（REP）。作用機(jī)理是當(dāng)體細(xì)胞處于低頻電場(chǎng)時(shí)不容易被極化，體細(xì)胞的相對(duì)介電常數(shù)低，但在某種特定頻率電場(chǎng)下易被極化，相對(duì)介電常數(shù)會(huì)明顯增大。Grillo等［5］通過兩年的研究，發(fā)現(xiàn)了在特定的條件下（即溫度為10～34 ℃、電壓為100 mV、電場(chǎng)頻率為300 kHz）相對(duì)介電常數(shù)與體細(xì)胞數(shù)之間存在的正相關(guān)性，基于此來檢測(cè)乳房炎的結(jié)果要比電導(dǎo)率檢測(cè)法稍準(zhǔn)確。

2　乳汁PH檢驗(yàn)法

正常牛乳汁的PH值通常在6.5～6.8之間。當(dāng)奶牛發(fā)生乳腺炎時(shí)，毛細(xì)血管的滲透性增加，偏堿性的血液成分進(jìn)入到乳汁中，從而導(dǎo)致牛奶的PH值增加。與體細(xì)胞間接計(jì)數(shù)法相比，PH法是一種定性方法，對(duì)于識(shí)別隱性乳房炎具有較好的敏感性且操作簡(jiǎn)單。

3　乳汁電導(dǎo)率檢測(cè)法

從20世紀(jì)40年代開始，人們就開始研究利用隱性乳房炎乳汁導(dǎo)電性增強(qiáng)的原理來檢測(cè)隱性乳房炎，但真正走向?qū)嵱没窃?0世紀(jì)80年代。

乳汁電導(dǎo)率檢測(cè)法的作用機(jī)理是，在正常情況下，牛血漿與牛奶的滲透壓相等，大約有75%由氯化鈉和乳糖形成。當(dāng)發(fā)生乳房炎時(shí)，乳腺上皮組織細(xì)胞制造乳糖能力下降，牛奶的滲透壓就低于血漿滲透壓，形成了血管壁與乳腺細(xì)胞之間滲透壓差，使Na+、Clˉ、HCO3ˉ等離子滲透到牛奶中，引起電導(dǎo)率的增加。電導(dǎo)率與體細(xì)胞數(shù)之間存在正相關(guān)性［6-8］，但此相關(guān)系數(shù)只有0.503 6，因此電導(dǎo)率檢測(cè)法存在很大誤差［9］。

電導(dǎo)率檢測(cè)法（CDM）與PH檢測(cè)法的原理相似，都是檢測(cè)乳汁中導(dǎo)電離子的濃度，只是電導(dǎo)率檢測(cè)法檢測(cè)的是多種離子的濃度，而PH檢測(cè)法只是檢測(cè)H+的濃度。

4　乳汁的細(xì)菌培養(yǎng)

以上三種方法可用于初步診斷奶牛隱性乳房炎，但進(jìn)一步確診需要進(jìn)行病原微生物的分離與鑒定。對(duì)乳汁中的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)染色形態(tài)特征選擇性地進(jìn)行3%氫氧化鉀試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、凝固酶試驗(yàn)、CAMP試驗(yàn)等鑒定致病菌。細(xì)菌培養(yǎng)操作繁瑣且工作量大，存在許多局限性，如患有隱性乳房炎的乳汁中體細(xì)胞數(shù)高，影響細(xì)菌的生長(zhǎng)，易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

5　PCR檢測(cè)方法

Phuektes等［10］、Riffon等［11］以16S～23S rDNA間隔區(qū)為擴(kuò)增靶序列，建立了多重PCR檢測(cè)方法。該方法能夠快速鑒定奶牛乳房炎的病原菌。武守艷等［12］同樣選擇了16S～23S rDNA區(qū)間，針對(duì)無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，并通過優(yōu)化退火溫度、引物濃度等擴(kuò)增條件，以及研究病原菌PCR擴(kuò)增的特異性和敏感性，確立了對(duì)這3種病原菌特異、敏感、快速的PCR鑒定和檢測(cè)方法，為PCR法在奶牛乳房炎的診斷方面奠定了基礎(chǔ)。通過該方法，無乳鏈球菌的靈敏性為104cfu/mL，金黃色葡萄球菌靈敏性為105cfu/mL，大腸桿菌靈敏性為103cfu/mL。肖穎等［13］也通過多重PCR方法設(shè)計(jì)了多對(duì)引物，針對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、致病性酵母菌及無乳鏈球菌等進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)隱性乳房炎的檢出率達(dá)82.5%.

PCR技術(shù)的應(yīng)用彌補(bǔ)了細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)的不足，尤其是在建立了多重PCR方法后，在病原菌的診斷上既節(jié)省了試劑的用量，又縮短了檢測(cè)時(shí)間［14］。

6　MTT檢測(cè)法

MTT是一種黃色的可接受氫離子的染料，能被活菌細(xì)胞內(nèi)線粒體膜上的琥珀酸脫氫酶還原成藍(lán)紫色的不溶性的甲臜類物質(zhì)，沉積在細(xì)胞中。而死細(xì)胞中無琥珀酸脫氫酶，則不會(huì)出現(xiàn)此現(xiàn)象。甲臜類物質(zhì)可以在含50%的N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亞砜（DMSO）中溶解，然后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在540 nm或720 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD值，以此間接反映活細(xì)胞數(shù)量。伊嵐等［15］通過實(shí)驗(yàn)將MTT法用于奶牛乳房炎的藥敏試驗(yàn)，有效、準(zhǔn)確、快速、篩選出了抗菌藥物，但由于甲臜類物質(zhì)需被溶解后才能檢測(cè)，大大增加了工作量。

7　其他診斷方法

7.1 乳成分直接檢測(cè)法

對(duì)乳成分的變化進(jìn)行直接檢測(cè)與分析，可以提高對(duì)隱性乳房炎的預(yù)測(cè)能力及奶牛的患病程度的診斷。

7.2 酶類檢測(cè)法

正常牛奶中10%～20%的NAGase由白細(xì)胞提供，剩下的均來自乳腺組織。當(dāng)奶牛患有乳房炎時(shí)，乳腺組織被破壞，NAGase釋放增加。另外，奶牛患有炎癥時(shí)白細(xì)胞釋放的NAGase也增加，乳中NAGase的活性顯著增加，Middleton研究證實(shí)了這一結(jié)論。因此，該方法可以準(zhǔn)確、可靠地判斷乳汁是否為乳房炎乳，但此檢測(cè)法工作量大，且儀器造價(jià)高。

7.3 生物芯片或微控檢測(cè)方法

崔傳金等［16］將生物芯片或微控檢測(cè)法應(yīng)用到奶牛乳房炎的檢測(cè)上，尤其是利用細(xì)胞的電容效應(yīng)、阻抗測(cè)試等，設(shè)計(jì)不同結(jié)構(gòu)的微傳感器或生物芯片來降低背景噪聲，極有可能解決細(xì)胞含量的檢測(cè)問題。這種檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)是傳感器制作成本低、檢測(cè)精度高且可現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，適用于基層奶牛養(yǎng)殖戶及大型牛場(chǎng)。

8　小結(jié)

以上所述的對(duì)奶牛隱性乳房炎的診斷方法，大多都只是建立在實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)上的，而不太適合基層奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)。目前養(yǎng)殖場(chǎng)使用最多的還是乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)法，而不論是直接體細(xì)胞計(jì)數(shù)法還是間接體細(xì)胞計(jì)數(shù)法都存在一定的優(yōu)缺點(diǎn)。直接體細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)準(zhǔn)確性高，但其檢測(cè)過程較為繁瑣，工作量大，自動(dòng)化程度高，檢測(cè)設(shè)備費(fèi)用高，適用于小樣本的精確檢測(cè)，不便于大范圍推廣，其應(yīng)用主要局限在大型的檢驗(yàn)中心和經(jīng)濟(jì)實(shí)力雄厚的大型奶廠和牛奶加工企業(yè)。間接體細(xì)胞計(jì)數(shù)法大多通過檢測(cè)牛奶體細(xì)胞所具備的不同物理、化學(xué)特性值，并通過它們與體細(xì)胞數(shù)量之間的關(guān)系對(duì)體細(xì)胞數(shù)進(jìn)行估算，可以快速檢測(cè)出奶牛是否患病，但對(duì)病癥嚴(yán)重的程度診斷能力有限，且檢測(cè)的精度不高，容易出現(xiàn)誤診。

因此完善乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)法，研究一種操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確有效且適用于從散養(yǎng)戶到任何規(guī)模牛場(chǎng)的檢測(cè)手段，是業(yè)內(nèi)人士研究的重點(diǎn)。例如，相關(guān)材料曾記載的被毛微量元素檢測(cè)法，利用檢測(cè)人、動(dòng)物毛發(fā)微量元素來診斷各種疾病。該方法的國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道有很多，但牛毛中微量元素與隱性乳房炎關(guān)系的報(bào)道很少見。如果能研究出一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便且有效的“牛毛診斷隱性乳房炎”的方法，相信會(huì)得以廣泛應(yīng)用。

總之，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展創(chuàng)新，對(duì)奶牛隱性乳房炎的診斷方法越來越多、越來越優(yōu)化，因此，必須選取最有效、最實(shí)惠、最適合養(yǎng)殖場(chǎng)的診斷方法，從而使奶牛養(yǎng)殖業(yè)健康、穩(wěn)定的發(fā)展。

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（責(zé)任編輯：杜憲）

Research Progress on Diagnostic Techniques of Recessive Mastitis in Dairy Cows

Ma Jinmei1，2，Chi Liang1，Zou Ming1，Liu Huanqi1
（1. Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109；2. Qixia Animal Health Supervision Institution，Qixia，Shandong 265300）

At the present time，the recessive mastitis has become one of the common diseases with high incidence in dairy cows，resulting in serious harm and great fi nancial loss in dairy industry. Major diagnostic techniques and methods of the disease were compared and analyzed in this article，including cell count，PH-value test of milk，conductivity detection of milk，milk bacterial culture，PCR assay and MTT test，so as to provide guidance for better selection and further study of the diagnosis method for recessive mastitis.

recessive mastitis in dairy cows；diagnostic technique；cell count；PH-value test of milk；conductivity detection of milk；milk bacterial culture；PCR assay；MTT test

S823

A

1005-944X（2016）11-0071-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.11.020

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-09-03）

劉煥奇