繆素娜戴煦徐維嘉

（華測(cè)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)股份有限公司廣東深圳518101）

對(duì)ISO 4134：1999標(biāo)準(zhǔn)的分析及修訂建議

繆素娜戴煦徐維嘉

（華測(cè)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)股份有限公司廣東深圳518101）

對(duì)肉和肉制品中L-（+）-谷氨酸含量測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了比較分析，指出國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 4134：1999存在明顯的技術(shù)爭(zhēng)議，進(jìn)而對(duì)ISO 4134：1999存在問(wèn)題與不足進(jìn)行了深入分析，并提出了一些具體的修訂建議，目的在于引起重視和廣泛討論，以促進(jìn)ISO 4134：1999的盡快修訂，提高其適用性。

ISO：1999；L-（+）-谷氨酸；測(cè)定；修訂；建議

1 前言

L-（+）-谷氨酸含量是肉和肉制品中的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[1]，L-（+）-谷氨酸在肉和肉制品中以自由流動(dòng)的游離態(tài)和構(gòu)成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的結(jié)合態(tài)兩種形式存在，其中游離態(tài)L-（+）-谷氨酸主要作為鮮味風(fēng)味前體物評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[2-7]，結(jié)合態(tài)L-（+）-谷氨酸主要作為蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[7]，兩者在肉和肉制品中的含量差別可達(dá)上百倍[7]，測(cè)定兩者具有不同的指導(dǎo)意義。目前國(guó)內(nèi)沒(méi)有專門針對(duì)肉和肉制品中L-（+）-谷氨酸測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)，其中國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測(cè)定》[8]能滿足肉和肉制品中L-（+）-谷氨酸的測(cè)定，其所測(cè)得的L-（+）-谷氨酸為總L-（+）-谷氨酸（游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的總和）。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 4134：1999《肉和肉制品中L-（+）-谷氨酸的測(cè)定參考法》[9]是專門針對(duì)肉和肉制品中L-（+）-谷氨酸含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)，其檢測(cè)原理是采用0℃的高氯酸溶液對(duì)試樣中的L-（+）-谷氨酸進(jìn)行提取，氧化態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）在谷氨酸脫氫酶（GIDH）存在的條件下被L-（+）-谷氨酸還原，得到的還原態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）在心肌黃酶的作用下與碘四唑硝基氯（INT）反應(yīng)生成甲瓚，用分光光度計(jì)在492 nm處測(cè)定甲瓚的吸收峰，從而計(jì)算L-（+）-谷氨酸含量。從ISO 4134：1999檢測(cè)原理看，其所測(cè)得的L-（+）-谷氨酸為游離態(tài)L-（+）-谷氨酸，但標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)其進(jìn)行明確界定和說(shuō)明，容易誤導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)使用者以為所測(cè)得的為總L-（+）-谷氨酸，從而覺(jué)得同一樣品采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.124-2003和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 4134：1999所測(cè)得的L-（+）-谷氨酸結(jié)果相差甚遠(yuǎn)，輕者造成困惑，甚者引起檢測(cè)糾紛或帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失。因此筆者認(rèn)為有必要對(duì)ISO 4134：1999標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行深入分析，并提出具體的修訂建議。

2 ISO 4134：1999標(biāo)準(zhǔn)存在問(wèn)題與不足

通過(guò)對(duì)ISO 4134：1999標(biāo)準(zhǔn)條文進(jìn)行解讀分析，并結(jié)合筆者多年研究經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為其存在以下問(wèn)題與不足。

2.1 存在問(wèn)題

（1）L-（+）-谷氨酸在肉和肉制品中分別以自由流動(dòng)的游離態(tài)和構(gòu)成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的結(jié)合態(tài)兩種形式存在，而標(biāo)準(zhǔn)中“9.2樣品前處理”關(guān)于L-（+）-谷氨酸提取過(guò)程，主要是將試樣用絞肉機(jī)絞爛后，取約50 g加入100 mL 0℃稀高氯酸溶液（1 mol/L）進(jìn)行均質(zhì)，均質(zhì)后離心過(guò)濾取濾液。由此可見(jiàn)該提取過(guò)程并沒(méi)有將構(gòu)成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的結(jié)合態(tài)L-（+）-谷氨酸水解釋放出來(lái)，也就是濾液中被檢測(cè)的L-（+）-谷氨酸實(shí)質(zhì)上僅為游離L-（+）-谷氨酸，筆者也通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)了這一個(gè)觀點(diǎn)。但標(biāo)準(zhǔn)文本并未對(duì)此進(jìn)行明確界定和說(shuō)明，容易誤導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)使用者。

（2）標(biāo)準(zhǔn)中5.7的心肌黃酶檢測(cè)溶液和5.9的谷氨酸脫氫酶溶液均以mg/mL為單位，但未標(biāo)識(shí)相應(yīng)的酶活力單位。由于酶活力單位是酶制劑最關(guān)鍵的指標(biāo)，該指標(biāo)的缺失，會(huì)使標(biāo)準(zhǔn)使用者在選購(gòu)和配制試劑時(shí)無(wú)可適從，從而導(dǎo)致檢測(cè)無(wú)法開(kāi)展或檢測(cè)失敗。

（3）根據(jù)ISO 1442：1997《肉和肉制品水分含量測(cè)定》[10]，Wm（水分含量）是以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（百分比）表示，從附錄C關(guān)于L-（+）-谷氨酸含量計(jì)算公式由來(lái)的推導(dǎo)看，10.3試樣L-（+）-谷氨酸的含量計(jì)算公式中的“Wm/100”不正確，應(yīng)去掉“/100”；另從附錄C關(guān)于計(jì)算公式由來(lái)的推導(dǎo)看，Wg實(shí)際指的是試樣（包括水分）的L-（+）-谷氨酸含量，因此公式下方的符號(hào)說(shuō)明“Wg是指試樣干基L-（+）-谷氨酸含量”的說(shuō)法有誤，應(yīng)去掉“干基”。

2.2 不足

（1）9.3的“繪制吸光值隨時(shí)間變化的曲線，將曲線反向延長(zhǎng)與縱坐標(biāo)交匯，推算反應(yīng)開(kāi)始時(shí)吸光值（參見(jiàn)附錄B）”的做法不科學(xué)。用曲線外推法尋找反應(yīng)起始值適用于隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)步增長(zhǎng)且沒(méi)有反應(yīng)終點(diǎn)的運(yùn)算[11]，而事實(shí)上標(biāo)準(zhǔn)中的檢測(cè)試劑是過(guò)量的，隨著L-（+）-谷氨酸消耗完畢，反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值則不再增大，因此正確的做法應(yīng)以反應(yīng)產(chǎn)物吸光值的穩(wěn)定值作為反應(yīng)終點(diǎn)，并以反應(yīng)終點(diǎn)的吸光值作為檢測(cè)結(jié)果。盡管L-（+）-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣檢測(cè)溶液均采用外推法推算反應(yīng)開(kāi)始時(shí)吸光值作為檢測(cè)結(jié)果，與均采用反應(yīng)終點(diǎn)吸光值作為檢測(cè)結(jié)果運(yùn)算得到的L-（+）-谷氨酸含量大體上一致，但采用外推法推算反應(yīng)開(kāi)始時(shí)吸光值得到的間接檢測(cè)結(jié)果肯定不如直接測(cè)得的反應(yīng)終點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠，具有造成檢測(cè)結(jié)果誤差增大的風(fēng)險(xiǎn)。

（2）標(biāo)準(zhǔn)中采用已知濃度的L-（+）-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.02 mg/mL）所對(duì)應(yīng)的吸光值差來(lái)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物甲瓚的摩爾吸光系數(shù)[12]進(jìn)行單點(diǎn)校正，然后根據(jù)甲瓚的摩爾吸光系數(shù)和試樣檢測(cè)溶液的吸光值差、稀釋倍數(shù)計(jì)算試樣L-（+）-谷氨酸含量。當(dāng)試樣檢測(cè)溶液L-（+）-谷氨酸濃度與L-（+）-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.02 mg/mL）相差較大時(shí)，容易造成檢測(cè)結(jié)果偏差較大，因此采用單點(diǎn)校正存在局限。

（3）反應(yīng)產(chǎn)物甲瓚由分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定均需人手單獨(dú)操作，終點(diǎn)判定需每隔2 min重復(fù)讀數(shù)直到讀數(shù)穩(wěn)定為止，操作繁瑣、檢測(cè)效率低。

3 ISO 4134：1999標(biāo)準(zhǔn)修訂建議

針對(duì)上述存在問(wèn)題與不足，筆者提出如下修訂意見(jiàn)：

（1）針對(duì)問(wèn)題1：對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定的L-（+）-谷氨酸進(jìn)行明確界定，并將標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定對(duì)象從僅為肉和肉制品中游離L-（+）-谷氨酸，擴(kuò)大到肉和肉制品中游離L-（+）-谷氨酸和總L-（+）-谷氨酸。相應(yīng)地，在術(shù)語(yǔ)定義增加游離L-（+）-谷氨酸和總L-（+）-谷氨酸的術(shù)語(yǔ)解釋；在檢測(cè)步驟里增加試樣總L-（+）-谷氨酸的提??；在吸光值測(cè)定里增加試樣檢測(cè)溶液總L-（+）-谷氨酸的吸光值測(cè)定；在結(jié)果計(jì)算和公式由來(lái)的推導(dǎo)里增加試樣總L-（+）-谷氨酸的計(jì)算公式及公式由來(lái)的推導(dǎo)。

（2）針對(duì)問(wèn)題2：補(bǔ)充心肌黃酶檢測(cè)溶液和谷氨酸脫氫酶溶液對(duì)應(yīng)酶活力單位的標(biāo)識(shí)。

（3）針對(duì)問(wèn)題3：將計(jì)算公式中的“Wm/100”更正為“Wm”。將計(jì)算公式下方的符號(hào)說(shuō)明“Wg是指試樣干基L-（+）-谷氨酸含量”更正為的“W1是指試樣游離L-（+）-谷氨酸含量”。

（4）針對(duì)不足1：將“繪制吸光值隨時(shí)間變化的曲線，將曲線反向延長(zhǎng)與縱坐標(biāo)交匯，推算反應(yīng)開(kāi)始時(shí)吸光值（參見(jiàn)附錄B）”修改為“以吸光值穩(wěn)定值做為反應(yīng)終點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果”，并相應(yīng)地將附錄B刪去。

（5）針對(duì)不足2：將L-（+）-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.02 mg/mL）更改為L(zhǎng)-（+）-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（0.006 g/L、0.010 g/L、0.020 g/L、0.040 g/L、0.060 g/L），對(duì)L-（+）-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行吸光值測(cè)定，建立L-（+）-谷氨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線和數(shù)學(xué)方程，代替L-（+）-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液?jiǎn)吸c(diǎn)校正。

（6）針對(duì)不足3：光吸收酶標(biāo)儀與分光光度計(jì)測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物吸光值的原理相似，理論上采用分光光度計(jì)的測(cè)定均可用光吸收酶標(biāo)儀代替，且光吸收酶標(biāo)儀具有分光光度計(jì)難以比擬的優(yōu)勢(shì)：光吸收酶標(biāo)儀為儀器自動(dòng)檢測(cè)，能對(duì)反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行在線實(shí)時(shí)監(jiān)控，可生成吸光值隨反應(yīng)時(shí)間變化的動(dòng)力學(xué)曲線，使檢測(cè)過(guò)程一目了然并能自動(dòng)識(shí)別反應(yīng)終點(diǎn)；光吸收酶標(biāo)儀最常用的反應(yīng)載體為96孔板，也就是一批次能檢測(cè)多達(dá)96個(gè)樣品，具有高通量快速并大量節(jié)省試劑成本的特點(diǎn)。因此提出在標(biāo)準(zhǔn)中新增一種測(cè)定L-（+）-谷氨酸的檢測(cè)方法——光吸收酶標(biāo)儀法。將標(biāo)準(zhǔn)的原檢測(cè)方法（分光光度計(jì)法）分類為第一法，將新增方法分類為第二法。第二法繼續(xù)沿用第一法的適用范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語(yǔ)定義、原理、抽樣、試樣制備及檢測(cè)步驟的樣品前處理章節(jié)內(nèi)容，在參照第一法的基礎(chǔ)上，對(duì)試劑、設(shè)備、檢測(cè)步驟的吸光值測(cè)定、結(jié)果計(jì)算與表達(dá)及公式由來(lái)的推導(dǎo)進(jìn)行修改和補(bǔ)充。

4 結(jié)語(yǔ)

本文通過(guò)對(duì)肉和肉制品中L-（+）-谷氨酸測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.124-2003和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 4134：1999進(jìn)行對(duì)比分析，認(rèn)為ISO 4134：1999存在明顯的技術(shù)爭(zhēng)議，進(jìn)而對(duì)ISO 4134：1999進(jìn)行了深入分析，并針對(duì)ISO 4134：1999存在問(wèn)題與不足提出了一些具體的修訂建議。這些修訂建議還有待于進(jìn)行深入的試驗(yàn)論證，以為ISO 4134：1999的修訂提供更為可靠的數(shù)據(jù)支撐。

由于理解角度和能力的限制，上述的分析及修訂建議難免偏頗，誠(chéng)請(qǐng)專家、學(xué)者們批準(zhǔn)指正。

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[9]ISO 4134：1999 Meat and meat products-Determination of L-（+）-glutamic acid content-Reference method[S].

[10]ISO1442：1997，Meatandmeatproducts-Determinationof moisture content（Reference method）[S].

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Analysis and Revision Suggestions on ISO 4134：1999

MIAO Suna，DAI Xu，XU Weijia
（Centre Testing International（Shenzhen）Ltd.，Shenzhen，Guangdong，518101）

This paper gives a comparative analysis on the national and international standards of meat and meat products determination of L-glutamic acid content，and points out that the international standard ISO 4134：1999 has obvious technical disputes，then makes a in-depth analysis on the existing problems and shortcomings of ISO 4134：1999，and puts forward some concrete revision suggestions，in order to arouse attention and extensive discussion for the current standard，to promote its revision and improve its applicability.

ISO：1999；L-（+）-Glutamic Acid；Determination；Revision；Suggestions

TS207

E-mail：miaosuna@cti-cert.com

2016-06-17