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自身啟動(dòng)子調(diào)控miR-7真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其意義

郭萌萌，廖珍媛，趙娟娟，陶弋婧，胡燕，陳超，秦娜琳，鄭靜，徐林

(遵義醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室暨貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 構(gòu)建帶有miR-7自身啟動(dòng)子的miR-7重組真核表達(dá)載體，研究其對(duì)人肺癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響。方法 預(yù)測(cè)miR-7啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)含有該序列和miR-7前體序列目的片段的引物，PCR擴(kuò)增后亞克隆入pGL3.0-Basic載體以構(gòu)建miR-7自身啟動(dòng)子調(diào)控的真核表達(dá)載體pGL3.0-Basic-miR-7-promoter(命名為p-miR-7-pro)；將所構(gòu)建載體轉(zhuǎn)染人肺癌95D細(xì)胞， Real-time PCR探針法檢測(cè)95D細(xì)胞中miR-7的表達(dá)水平；MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)95D細(xì)胞的增殖和克隆形成能力；劃痕法觀察95D細(xì)胞體外遷移能力的變化；FACS檢測(cè)95D細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果 酶切和測(cè)序結(jié)果證明成功構(gòu)建p-miR-7-pro真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染95D細(xì)胞后可有效表達(dá)miR-7；與對(duì)照組相比，p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞的體外增殖能力受到明顯的抑制(0.60±0.03 vs 0.19±0.05，P<0.05)；同時(shí)其遷移能力也顯著降低(473±7 vs 99±2，P<0.05)；而細(xì)胞凋亡則顯著增加(9.233±0.586 % vs 12.967±0.643%，P<0.05)。結(jié)論 成功構(gòu)建由自身啟動(dòng)子調(diào)控的miR-7真核表達(dá)載體，為后續(xù)研究miR-7在肺癌基因治療中的作用提供重要實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]miR-7；真核表達(dá)；肺癌；95D細(xì)胞；增殖；遷移；凋亡

啟動(dòng)子(Promoter)是一段位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游區(qū)的DNA序列，是RNA聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合的部位，控制基因表達(dá)的起始時(shí)間、轉(zhuǎn)錄方向、模板鏈以及轉(zhuǎn)錄效率。啟動(dòng)子的強(qiáng)弱、位點(diǎn)突變以及CpG島的甲基化，都可能導(dǎo)致基因表達(dá)的調(diào)控障礙[1-2]。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是長(zhǎng)約為22個(gè)核苷酸的高度保守的單鏈非編碼RNA，它從DNA轉(zhuǎn)錄，但不能翻譯成蛋白，在轉(zhuǎn)錄后水平通過對(duì)多重靶基因的負(fù)調(diào)節(jié)參與調(diào)控細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖和凋亡等多種生物學(xué)進(jìn)程[3-4]。miRNAs啟動(dòng)子的活性對(duì)于miRNAs的表達(dá)具有重要作用[5-6]。而近年來(lái)的研究顯示，腫瘤的發(fā)生中多種miRNA表達(dá)異常與其啟動(dòng)子的活性密切相關(guān)[7-9]。如Baer C等研究報(bào)道，啟動(dòng)子DNA甲基化與miRNA(miR-21、miR-34a、miR-155等)成熟體的表達(dá)成反比，并且miR-21的啟動(dòng)子甲基化水平與慢性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)展密切相關(guān)[5,8]。類似的Lei等研究發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子CpG島的高甲基化使miR-129-2-3p表達(dá)下調(diào)，從而影響胃癌的發(fā)生發(fā)展[9]。因此，對(duì)miRNAs基因啟動(dòng)子(核心序列)的結(jié)構(gòu)和功能的分析研究，有利于進(jìn)一步探討腫瘤的發(fā)生機(jī)制，同時(shí)對(duì)于開發(fā)腫瘤臨床基因治療的新靶標(biāo)也將有非常積極的影響。

微小RNA-7(MicroRNA-7，miR-7)是近年來(lái)報(bào)道的miRNAs家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)[10-12]它在包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，并能夠有效抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移侵襲。然而miR-7啟動(dòng)子活性及調(diào)控機(jī)制等仍遠(yuǎn)未闡明，在肺癌中異常表達(dá)的調(diào)控因素也未明確。因此，本研究擬構(gòu)建了帶有miRNA-7基因自身啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體，鑒定其表達(dá)活性，并初步探討該載體對(duì)人肺癌95D細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移以及凋亡方面的影響，可為后續(xù)研究miRNA-7表達(dá)變化調(diào)控因素，明確其在肺癌發(fā)生中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及在臨床腫瘤基因治療中的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株DH5α大腸桿菌菌株(本實(shí)驗(yàn)室保存)；人源性肺巨細(xì)胞癌95D細(xì)胞株(中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)。

1.1.2主要試劑與儀器pGL3-Basic、LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑(invitrogen)；限制性內(nèi)切酶NheⅠ、BglⅡ(Takara)；T4連接酶、RevertAidTMFirstStrand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)；PCR試劑、Premix Ex Taq Version2.0、RNAisoTMPlus(Takara)；引入酶切位點(diǎn)包含miR-7啟動(dòng)子序列引物合成及測(cè)序(北京華大基因)；質(zhì)粒抽提試劑盒(天根生化科技有限公司)；miR-7的Real-time PCR探針試劑盒(MBI)；胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI 1640(Hyclone)。

IX-51倒置顯微鏡、IX-71倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS)；低溫臺(tái)式高速離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；PCR儀、Gel DocTM XR+凝膠成像系統(tǒng)、穩(wěn)壓DNA電泳儀、熒光定量PCR儀(Bio-Rad)；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)。

1.2方法

1.2.1miR-7啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)及引物設(shè)計(jì)從Pubmed上調(diào)取含miR-7成熟體3’端70 bp基因組序列(基因序列號(hào)：AJ550392)，通過GeneBank獲得miR-7成熟體前段5’端-1 068位點(diǎn)到其3’端側(cè)翼+124位點(diǎn)的序列，通過Primer5設(shè)計(jì)包含預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子區(qū)域的1 302 bp大小的引物；根據(jù)pGL3.0-Basic的MCS區(qū)的酶切位點(diǎn)，篩選并在引物(上游和下游)引入酶切位點(diǎn)(NheⅠ和BglⅡ)；引物序列：上游(引入NheⅠ位點(diǎn))5’ CTAGCTAGCTAGAGCACCAATAGGGAAGGG-3’；下游引物(引入BglⅡ位點(diǎn))5’ GAAGATCTTCGAGTCTGCCGATGGGTGT-3’。預(yù)期產(chǎn)物大小，1 302 bp。

1.2.2 pGL3.0-Basic-miR-7-promoter表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定抽提人肺癌95D細(xì)胞基因組DNA并作為模板，用設(shè)計(jì)的引物PCR反應(yīng)擴(kuò)增包含miR-7啟動(dòng)子、miR-7和3’段側(cè)翼序列在內(nèi)的目的片段，擴(kuò)增條件：95 ℃1 min,95 ℃30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,36個(gè)循環(huán)，72 ℃8 min。產(chǎn)物凝膠電泳后回收目的片段(1 302 bp)，送北京華大基因公司測(cè)序，用BLAST程序進(jìn)行結(jié)果比對(duì)，結(jié)果顯示啟動(dòng)子核心序列完整且不存在突變。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)NheⅠ和BglⅡ雙酶切后回收并連入表達(dá)載體pGL3.0-Basic(T4DNA連接酶，22 ℃，1 h)。繼而轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌E.coli DH5α，挑取其中的陽(yáng)性克隆(Amp(+))培養(yǎng)后，菌液PCR和凝膠電泳鑒定；并進(jìn)行質(zhì)粒小量抽提，雙酶切(NheI和BglII)來(lái)篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒，送北京華大基因測(cè)序，結(jié)果顯示pGL3.0-Basic-miR-7-promoter表達(dá)載體構(gòu)建成功，命名為p-miR-7-pro(對(duì)應(yīng)的pGL3.0-Basic命名為p-Cont)。

圖1　pGL3.0-Basic-miR-7-promoter真核表達(dá)載體的示意圖

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染培養(yǎng)95D細(xì)胞，條件：RPMI1640細(xì)胞完全培養(yǎng)液(10%胎牛血清、100 mg/mL鏈霉素、1 000μ/mL青霉素以及2 mmol/L谷氨酰胺)，37 ℃、5%CO2。當(dāng)單層細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%融合后，用胰蛋白酶(0.02%)消化收集細(xì)胞，PBS輕柔沖洗，將1×105/mL的細(xì)胞接種至6孔板(每孔2 mL)，培養(yǎng)12 h ，按照LipofectamineTM2 000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書瞬時(shí)轉(zhuǎn)染95D細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為2組：pGL3.0-Basic-miR-7-promoter(p-miR-7-pro)和pGL3.0-Basic空載(p-Cont)轉(zhuǎn)染組。所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)n=3，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染95D細(xì)胞表達(dá)水平的檢測(cè)將1×105/mL的細(xì)胞接種于24孔板(每孔500μL)，10 μg質(zhì)粒p-miR-7-pro和對(duì)照質(zhì)粒p-Cont體外分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染95D細(xì)胞，5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，抽提各組細(xì)胞總RNA，利用Realtime PCR探針法檢測(cè)miR-7的表達(dá)水平。

1.2.5p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染對(duì)95D細(xì)胞增殖的影響轉(zhuǎn)染48 h后，分別收集2個(gè)轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞懸液，以1.5×104/mL個(gè)細(xì)胞接種于96孔板(每孔200 μL)，培養(yǎng)72 h(37 ℃、5%CO2)，每孔加入50 μL MTT液(2 μg/mL)，孵育4 h，吸出培養(yǎng)基，每孔加入DMSO液150 μL，微孔板振蕩器振蕩培養(yǎng)板10 min，溶解結(jié)晶物，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光度(OD)值(波長(zhǎng)570 nm)。

1.2.6p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染對(duì)95D細(xì)胞體外克隆形成的影響轉(zhuǎn)染48 h后，分別收集2個(gè)轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞，將細(xì)胞懸液按每孔100、1 000個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中并確保細(xì)胞均勻分散；培養(yǎng)10～15 d，期間根據(jù)情況更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)有肉眼可見的克隆后即可終止培養(yǎng)，吸掉培養(yǎng)基并用PBS輕柔洗滌2～3次，自然干燥后固定30 min(4%多聚甲醛)，吸出甲醛待其干燥后，使用結(jié)晶紫染液(1%)染色30 min，PBS輕柔多次清洗直至洗去染液，自然干燥后拍照記錄。

1.2.7p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染對(duì)95D細(xì)胞遷移的影響收集95D細(xì)胞，以7×104/mL接種于24孔板，待細(xì)胞充分貼壁后，分別將p-miR-7-pro和p-Cont載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，6h后用1 mL槍頭于每孔中線處劃出2 mm的刮痕，PBS洗滌2～3次直至刮痕內(nèi)無(wú)細(xì)胞后加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，顯微鏡下觀察計(jì)算刮痕內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，并拍照。

1.2.8p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染對(duì)95D細(xì)胞凋亡的影響收集轉(zhuǎn)染后48h的p-miR-7-pro和p-Cont轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，PBS洗1次，過濾，離心，棄上清，每管加入Annexin V-APC熒光標(biāo)記抗體2 μL，4 ℃避光孵育10～15 min，PBS洗滌2遍，每管分別加入PI 熒光標(biāo)記抗體2 μL，冰上避光孵育10 min ，F(xiàn)ACS檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1miR-7 啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)如圖2所示，通過GeneBank獲得miR-7前段5’端-1068位點(diǎn)到其3’端側(cè)翼+124位點(diǎn)的序列，利用Primer5設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)引物；引物序列：上游，5’ CTAGCTAGCTAGAGCACCAATAGGGAAGGG-3’;下游引物：5’ GAAGATCTTCGAGTCTGCCGATGGGTGT-3’。預(yù)期產(chǎn)物大小1 302 bp。

圖2　miR-7啟動(dòng)子區(qū)域示意圖

2.2PCR擴(kuò)增miR-7啟動(dòng)子區(qū)序列以肺癌95D細(xì)胞DNA為模板，PCR擴(kuò)增含miR-7成熟體3’端70 bp堿基的啟動(dòng)子序列，如圖3所示，電泳后可見1 302 bp大小的目的條帶。

M:Marker?！　　D3　miR-7啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.3p-miR-7-pro載體陽(yáng)性克隆PCR鑒定純化的目的片段經(jīng)雙酶切后(NheⅠ和BglII)連入pGL3.0-Basic載體，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌E.coli DH5α，Amp(+)培養(yǎng)12 h后隨機(jī)挑取6個(gè)克隆，繼續(xù)培養(yǎng)16 h，最后菌液PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，6個(gè)克隆培養(yǎng)擴(kuò)增后均可見1302 bp大小的目的條帶(見圖4)，提示其均為陽(yáng)性克隆。

1～6:6個(gè)不同的克降培養(yǎng)后菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果；M：Marker。圖4　菌液PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.4p-miR-7-pro載體的酶切和測(cè)序鑒定重組載體p GL3.0-Basic-miR-7-pro經(jīng)雙酶切后(NheI,Bgl Ⅱ)，電泳結(jié)果可見約4.8 kb及1302 bp大小的2條片段 (見圖5A)；測(cè)序結(jié)果顯示(見圖5B)，插入片段正確 ，結(jié)果表明pGL3.0-miR-7-promoter表達(dá)載體構(gòu)建成功，命名為p-miR-7-pro(對(duì)應(yīng)的pGL3.0-Basic命名為p-Cont)。

A:重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果 (M:Marker);B:重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果圖5　重組質(zhì)粒雙酶切與測(cè)序鑒定

2.595D細(xì)胞轉(zhuǎn)染p -miR-7 -pro載體后miR-7表達(dá)水平檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后，利用Real-time PCR探針法檢測(cè)miR-7成熟體的表達(dá)水平。如圖6所示，p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染組miR-7成熟體的表達(dá)水平較p-Cont組顯著升高，提示該啟動(dòng)子可以有效啟動(dòng)miR-7的表達(dá)。

2.6p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染抑制95D細(xì)胞的增殖MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖7)顯示，與對(duì)照組相比，p -miR-7-pro轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖能力明顯降低。

*P<0.05,vs-p-Cont?！　D6　Real-time PCR檢測(cè)p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染95D細(xì)胞后miR-7的表達(dá)

*P<0.05, vs p-Cont?！D7　p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染抑制95D細(xì)胞體外增殖

2.7p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染對(duì)95D細(xì)胞體外克隆形成的影響克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖8)顯示，每孔100和1000個(gè)細(xì)胞的接種條件下，p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞克隆形成數(shù)均較p-Cont組明顯減少(14±4vs31±5個(gè); 77±7vs122±6個(gè)，P<0.05)。結(jié)果表明，miR-7既可以抑制肺癌95D細(xì)胞的增殖，也可以影響其克隆形成的能力。

2.8p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染抑制95D細(xì)胞的遷移劃痕法結(jié)果(見圖9)顯示，與p-Cont轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比，p-miR-7-pro組95D細(xì)胞的體外遷移能力受到了明顯的抑制，48h后p-miR-7-pro-95D轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移數(shù)明顯少于p-Cont組 ：(99±2vs473±7，P<0.05)，72h 后為 (399±6vs1339±20，P<0.05)。結(jié)果提示，miR-7過表達(dá)可以抑制95D細(xì)胞的體外遷移能力。

2.9p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)95D細(xì)胞的凋亡采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果(見圖10)顯示，與對(duì)照組相比，p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡比例明顯增加 (9.233±0.586%vs12.967±0.643%，P<0.05)。結(jié)果表明，過表達(dá)miR-7可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞95D細(xì)胞凋亡增加。

A:1000個(gè)細(xì)胞/孔；B:100個(gè)細(xì)胞/孔；*P<0.05，vs p-Cont。圖8　 p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染抑制95D細(xì)胞的克隆形成能力

A:0 h (100×);B:48 h (100×);C:72 h(100×)；*P<0.05，vs p-Cont。圖9　p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染抑制95D細(xì)胞體外遷移

*P<0.05,vs p-Cot。圖10　p-miR-7-pro轉(zhuǎn)染后誘導(dǎo)95D細(xì)胞的凋亡

3討論

MiRNA-7是新近報(bào)道的miRNA家族成員之一，定位于第15號(hào)染色體。研究發(fā)現(xiàn)，miR-7在正常肺組織中高表達(dá)，但在臨床肺癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)；當(dāng)過表達(dá)miR-7時(shí)，肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及侵襲能力都受到明顯的抑制[13-14]。這與我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)miR-7模擬物(mimics)和真核表達(dá)載體可過表達(dá)miR-7，并通過下調(diào)IGFIR、EGFR和p-Akt的表達(dá)水平，從而顯著抑制肺癌細(xì)胞的體外增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲是一致的[15-18]。這些研究均提示miRNA-7是肺癌發(fā)生發(fā)展中的重要調(diào)控分子。因此進(jìn)一步明確miR-7在肺癌發(fā)生中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，對(duì)于miR-7基因功能的研究，以及在臨床腫瘤治療中利用miR-7進(jìn)行基因診斷、預(yù)防和治療都具有十分重要的作用。

由于miRNAs分子在基因組上定位的復(fù)雜性，導(dǎo)致對(duì)其啟動(dòng)子鑒定和活性研究工作開展較為困難。本研究利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)[19]，在miR-7成熟體前段至其5’端-1068位點(diǎn)間存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(如，Gfi-1，c-Myc等)的潛在結(jié)合位點(diǎn)，提示該段序列具有啟動(dòng)子活性。為了驗(yàn)證該段序列是否為miR-7啟動(dòng)子序列，本實(shí)驗(yàn)利用分子克隆技術(shù)，設(shè)計(jì)含miR-7啟動(dòng)子、miR-7和3’段側(cè)翼序列在內(nèi)的目的片段的引物，以人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞系95D基因組DNA為模板，擴(kuò)展出1302bp大小的目的片段；經(jīng)NheI和BglⅡ雙酶切、純化后亞克隆入無(wú)啟動(dòng)子、增強(qiáng)子的pGL3.0-Basic載體，從而構(gòu)建miRNA-7自身啟動(dòng)子的miR-7真核表達(dá)載體；酶切和測(cè)序結(jié)果表明，成功構(gòu)建載體pGL3.0-Basic-miR-7-promoter(命名為p-miR-7-pro)。更重要的是，將該載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人肺癌95 D細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組miR-7成熟體的表達(dá)水平顯著增加，這提示miR-7成熟體前段至其5’端-1068位點(diǎn)間存在miR-7自身啟動(dòng)子，其可有效啟動(dòng)miR-7成熟體的表達(dá)。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)p-miR-7-pro過表達(dá)的miR-7可顯著抑制人肺癌95D細(xì)胞的體外增殖和遷移能力，這與我們前期結(jié)果一致[16-18]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)95D細(xì)胞的凋亡也明顯增加。類似地，Xiong[20]等報(bào)道過表達(dá)miR-7可以在體外誘導(dǎo)人肺癌 A549細(xì)胞的凋亡。新近，Li等還發(fā)現(xiàn)人抗原R (human antigen R, HuR)可以在mRNA水平調(diào)控miR-7成熟體的表達(dá)[21]，這些研究提示了miR-7在肺癌中表達(dá)調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性。因此，深入探討miR-7啟動(dòng)子活性變化機(jī)制對(duì)于最終闡明以miR-7為代表的miRNA分子在人肺癌發(fā)生中的作用具有重要意義。

總之，本研究成功構(gòu)建帶有miRNA-7自身啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體，并觀察其對(duì)肺癌95D細(xì)胞的影響，這對(duì)于進(jìn)一步研究肺癌發(fā)生中miR-7表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，以及針對(duì)肺癌臨床基因治療中基于miR-7治療新方案的開發(fā)具有重要意義。

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[收稿2015-03-11;修回2015-04-26]

(編輯：譚秀榮)

·學(xué)術(shù)動(dòng)態(tài)·

Construction of an eukaryotic expression vector encoding miRNA-7 with self promoter and its significance

GuoMengmeng，LiaoZhenyuan，ZhaoJuanjuan，TaoYijing，HuYan，ChenChao，QinNalin，ZhengJing，XuLin

(Department of Immunology，Immunology Graduate Education and Innovation Base of Guizhou Province，Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563099，China)

[Abstract]Objective To construct an eukaryotic expression vector encoding miRNA-7 (miR-7) with its own promoter and explore its effects on the growth, migration and apoptosis of lung cancer cells.Methods The PCR primer was designed to amplify the promoter sequence and precursor sequence fragment of miR-7. The PCR products were subcloned into pGL3.0-Basic vector to construct the eukaryotic expression vector pGL3.0-Basic-miR-7-promoter (Named as p-miR-7-pro). Then, the recombinant plasmid p-miR-7-pro was transiently transfected into human lung cancer cell line 95D cells in vitro. The expression level of miR-7 in 95D cells was detected by real-time PCR. The proliferation and colony formation ability of cells were detected by MTT assay and colony formation assay, respectively. The migration of cells in vitro was determined by scratch assay. The apoptosis of cells was investigated by flow cytometry analysis.Results Enzyme digestion and DNA sequencing validated the successful construction of p-miR-7-pro eukaryotic expression vector. The expression level of miR-7 in p-miR-7-pro transfected group was higher than that in control group. Moreover, compared with control group (p-Cont), the proliferation and migration ability of cells in p-miR-7-pro-transfected group significantly decreased, respectively(0.60±0.03 vs 0.19±0.05，P<0.05)(473±7 vs 99±2，P<0.05). Conversely, the apoptosis of 95D cells significantly increased (9.233±0.586 % vs 12.967±0.643%, P<0.05).Conclusion The eukaryotic expression vector encoding miRNA-7 with self promoter is successfully constructed, which provides an important foundation for the study on the effects of miR-7 in gene therapy against lung cancer.

[Key words]miR-7; eukaryotic expression; lung cancer; 95D cell; proliferation; migration；apoptosis

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中圖法分類號(hào)] R734.2 A

[文章編號(hào)]1000-2715(2015)03-0219-07

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO:31370918)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃資助項(xiàng)目(NO:NCET-12-0661);貴州省國(guó)際合作項(xiàng)目(NO:10C315)。[通信作者]徐林，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤免疫，E-mail:xulinzhouya@163.com。