李　今 ,楊佐偉,熊　倩

(1.食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 黃石　435002;2.湖北師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石　435002)

一種微囊藻計數(shù)方法的研究

李今1,2,楊佐偉2,熊倩2

(1.食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 黃石435002;2.湖北師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石435002)

摘要：實(shí)驗(yàn)對微囊藻進(jìn)行水浴加熱處理，對微囊藻在不同溫度下群體大小以及單細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行比較,并進(jìn)一步研究不同溫度對微囊藻計數(shù)結(jié)果的影響。

關(guān)鍵詞：微囊藻；計數(shù)；溫度

中圖分類號：Q14,Q948.11

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-2714(2015)04- 0100- 04

doi:10.3969/j.issn.1009-2714.2015.04.019

收稿日期：2015—05—18

基金項(xiàng)目：黃石市科技攻 關(guān)項(xiàng)目(2013A067-2);食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金.

作者簡介：李今(1968—)，男，湖南衡陽人，博士，教授，主要從事水體生態(tài)恢復(fù)方面研究.

0前言

微囊藻屬M(fèi)icrocystis隸屬于藍(lán)藻門Cyanophyta、色球藻目Oococcales、微囊藻科Microcystaceae，群體微小或大型自由漂浮[1]。微囊藻適應(yīng)溫度為25℃～30℃，PH為8.0～9.5的水域生長，在環(huán)境條件適合其生長時會大規(guī)模繁殖形成水華[2]。水華微囊藻問題在國內(nèi)日益嚴(yán)重，就磁湖而言,每年夏季都會爆發(fā)大規(guī)模微囊藻水華。微囊藻水華爆發(fā)不僅會對湖泊生態(tài)系統(tǒng)帶來嚴(yán)重的危害[3]，而且嚴(yán)重影響人們的生產(chǎn)生活。水華微囊藻散發(fā)出的刺鼻氣味會影響周邊居民的正常生活，同時有毒微囊藻水華產(chǎn)生的毒素將影響人類的生產(chǎn)生活用水[4～5]。

微囊藻在自然水體中極易聚集成群生長，并且組成群體的微囊藻是隨機(jī)的，數(shù)量不等，不同群體的大小差異巨大[6]，造成了微囊藻計數(shù)困難?，F(xiàn)在常用于的藻類計數(shù)方法——直接鏡檢法[7]，由于微囊藻群體的影響，以個體計數(shù)法和群體計數(shù)法都會使得計數(shù)存在很大的隨機(jī)性，不能科學(xué)快速地計數(shù)出微囊藻數(shù)量。一定頻率的超聲波能使微囊藻群體解體成小群體，因此，現(xiàn)在也有使用以一定頻率的超聲波處理一段時間后再使用直接鏡檢法計數(shù)[8]，但微囊藻處理會造成細(xì)胞不同程度的損失，對計數(shù)帶來誤差[8，9～12]。其他方法包括電子微粒計數(shù)法，流式細(xì)胞儀，圖像分析法，回歸方程計數(shù)法，TiO2等，都有一定的局限性[9～11，13]。

在一些研究中發(fā)現(xiàn)，加熱使得微囊藻群體解散成為單個的微囊藻，并不會對微囊藻細(xì)胞造成損失[9～12]。本實(shí)驗(yàn)利用這一特性，用水浴加熱的方法對微囊藻進(jìn)行處理，使微囊藻細(xì)胞群體解體成單細(xì)胞或小群體，方便計數(shù)，提高微囊藻計數(shù)的精確性。

1實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料采集地點(diǎn)及時間

實(shí)驗(yàn)材料取于五一湖水下0.4m的水樣，取材時間為8月份水華爆發(fā)時間，主要藻種為藍(lán)藻門水

華微囊藻和銅綠微囊藻。由于采集時間為水華爆發(fā)時間，水樣中藻細(xì)胞密度過大，將采集的水樣以1∶7的比例進(jìn)行稀釋。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

稀釋后水樣在不同溫度梯度下水浴加熱5min.用血球計數(shù)板在顯微鏡(外接成像系統(tǒng))40倍鏡下計量單個群體的最大投影面積以及計數(shù)區(qū)域內(nèi)的群體數(shù)量，同時記錄單個細(xì)胞的數(shù)量。采集時溫為30℃，實(shí)驗(yàn)設(shè)計30℃、40℃、50℃、60℃、70℃ 5個溫度梯度，每個梯度做5個平行樣，每個平行樣做4個裝片進(jìn)行觀察取平均值。

1.3　密度計算

密度計算公式為N=Vs·n/Va

式中N為1L水中浮游植物密度(個/L)；Vs為定量體積取1L；n為計數(shù)體積觀察的個數(shù)；Va為計數(shù)體積。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1　群落的解體及藻單細(xì)胞數(shù)量變化

微囊藻群體在經(jīng)過水浴五分鐘處理后，藻液在30℃~70℃之間的溫度梯度下單細(xì)胞數(shù)量如圖1所示。細(xì)胞群體數(shù)量與大小數(shù)量變化如圖2所示。

圖1　不同溫度下微囊藻單細(xì)胞數(shù)量變化

圖2　微囊藻群體最大投影面積隨水浴溫度的變化趨勢

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：從30℃開始，微囊藻單細(xì)胞數(shù)量隨著溫度的升高而增多，30℃的單個細(xì)胞數(shù)量3.15×1011個/L，到60℃達(dá)到139.2×1011個/L.溫度達(dá)到60℃后，群體已經(jīng)基本消失，再繼續(xù)升溫，藻細(xì)胞的數(shù)量不再增加，溫度過高甚至?xí)?dǎo)致微囊藻單細(xì)胞解體，藻細(xì)胞數(shù)量減少。因此，微囊藻群體的最適解體溫度在60℃左右。在60℃左右時，群體已基本解體，微囊藻以單細(xì)胞的形式存在，數(shù)量基本固定，繼續(xù)升溫反而會導(dǎo)致微囊藻細(xì)胞的損失，造成計數(shù)的誤差。

圖2所示為微囊藻群體最大投影面積在不同溫度下的變化趨勢。在溫度為30℃時，微囊藻群體最大投影面積達(dá)到12500μm2，群體大小沒有規(guī)律，不同大小的群體均存在。當(dāng)溫度達(dá)到50℃時，微囊藻群大小主要集中在500～2500μm2范圍內(nèi)，并且群體數(shù)量呈下降趨勢。溫度60℃以后，群體數(shù)量繼續(xù)減少，而且沒有面積超過2500μm2的大群體。與之對應(yīng)的微囊藻單細(xì)胞數(shù)量隨著溫度的升高在逐漸的增多(圖1)。隨著溫度的升高，微囊藻的群體越來越小，大群體數(shù)量變少，溫度達(dá)到70℃時微囊藻群體群體全部解體為單個藻細(xì)胞，并且微囊藻單細(xì)胞也開始解體，細(xì)胞密度隨之減少。

2.2　處理前后對比

微囊藻經(jīng)過水浴處理后，微囊藻群體大小以及單細(xì)胞數(shù)量有明顯的變化，有部分沒有完全分散成單細(xì)胞的微囊藻群體在水浴后由處理前的多層細(xì)胞變?yōu)閱螌蛹?xì)胞，給計數(shù)帶來了極大的方便(圖3)。

處理前 處理后

圖3處理前和60℃處理后藻體變化

微囊藻經(jīng)過水浴加熱后每個溫度做五次平行樣進(jìn)行計數(shù)，結(jié)果如表1所示。

表1　不同溫度下微囊藻單細(xì)胞數(shù)量

注：數(shù)量單位：×1010cells/L

對微囊藻水浴加熱后，以傳統(tǒng)的鏡檢法計數(shù)，結(jié)果顯示：在一定溫度(60℃)內(nèi)，微囊藻計數(shù)相對偏差隨著溫度的逐漸升高而減小，微囊藻的計數(shù)誤差在隨著水浴溫度的升高而降低，當(dāng)溫度達(dá)到60℃以上時，計數(shù)的誤差又開始增加，這是由于溫度升高后，微囊藻的單細(xì)胞開始解體，計數(shù)結(jié)果比實(shí)際結(jié)果偏低，造成計數(shù)上的誤差。

3結(jié)論

經(jīng)過水浴處理后的微囊藻基本都由大群體解體成為可計數(shù)的小群體，而小的群體則直接解體成為單細(xì)胞。因此，在一定的范圍內(nèi)微囊藻群體隨著溫度的升高解體的越徹底，微囊藻藻液的均勻度在溫度升高過程中逐漸升高，微囊藻的計數(shù)在水浴加熱后變得更加準(zhǔn)確。這一方法的實(shí)現(xiàn)，突破了以前超聲波，OD-密度法以及直接鏡檢法等其他方法的一些局限性，為微囊藻計數(shù)帶來一種新的方法，提高了微囊藻計數(shù)準(zhǔn)確率，并且該方法操作簡單，使用要求低，是一種比較好的方法。在此方法上需要進(jìn)一步確定更為細(xì)小的溫度梯度以及更準(zhǔn)確的水浴時長實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)更為精確的計數(shù)。同時需要對更多的微囊藻種類的最佳水浴溫度進(jìn)行試驗(yàn)，使該方法能更廣泛地適用于微囊藻計數(shù)。

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Research on a method of counting microcystin

LI Jin1,2，YANG Zuo-wei2,XIONG Qian2

(1.Hubei Key Laboratory of Edible Wild Plants Conservation & Utilization,Huangshi435002,China;

2.College of Life Sciences, Hubei Normal University, Huangshi435002，China)

Abstract :In this study, Microcystis water bath heat treatment,Microcystis population size at different temperatures and the number of single cells were compared. And further study of the effects of different temperatures on microcystin count results.

Key words:microcystis; count; temperature