楊成德，暢濤，薛莉，馮中紅，姚玉玲，李婷，陳秀蓉

(草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室,甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院,甘肅省草業(yè)工程實驗室,

中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070)

珠芽蓼內(nèi)生細菌ZA1的抑菌物質(zhì)產(chǎn)生條件的優(yōu)化及其穩(wěn)定性測定

楊成德*，暢濤，薛莉，馮中紅，姚玉玲，李婷，陳秀蓉

(草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室,甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院,甘肅省草業(yè)工程實驗室,

中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070)

摘要：從珠芽蓼中分離的內(nèi)生細菌ZA1對馬鈴薯壞疽病菌具有良好的抑菌效果，鑒定為莫海威芽孢桿菌。本文通過平板對峙法對ZA1分泌物抑制馬鈴薯壞疽病菌的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，并對ZA1抑菌粗提物的穩(wěn)定性進行了測定。結(jié)果表明，ZA1的最佳培養(yǎng)基為B培養(yǎng)液，最佳發(fā)酵溫度為17.8℃，培養(yǎng)基的最佳pH是6.9，150 mL三角瓶的最佳裝液量為20 mL，最佳培養(yǎng)方式為暗處理振動培養(yǎng)96 h，經(jīng)對ZA1進行優(yōu)化培養(yǎng)，其對馬鈴薯壞疽病菌的EC50=0.1228 μL/mL，是優(yōu)化前EC50=4.5888 μL/mL的37倍。ZA1的抑菌粗提物90℃下處理2 h，其相對活性達到76.62%，具有耐高溫的特性；對紫外線照射30 min后相對活性差異不明顯； pH為3和11時，其相對活性分別為92.87%和85.11%；對蛋白酶和Ag+、Cu2+、Zn2+和Fe3+等金屬離子不敏感，經(jīng)Ag+處理后的相對活性可達到86.93%。

關鍵詞：珠芽蓼內(nèi)生菌；莫海威芽孢桿菌；抑菌粗提物；培養(yǎng)條件；穩(wěn)定性

Optimizing the culture conditions and determining the stability of antibiotic secretion byPolygonumviviparumof the endophytic bacteriaBacillusmojavensis

YANG Cheng-De*, CHANG Tao, XUE Li, FENG Zhong-Hong, YAO Yu-Ling, LI Ting, CHEN Xiu-Rong

KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity,PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince,Sino-U.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China

Abstract:One strain of Bacillus mojavensis (ZA1) is known to have a strong antibacterial effect against the pathogen of potato gangrene (Phoma foveata). In this study, P. foveata was isolated as a fungal pathogen and the method of petri dish confrontation was used to determine culture conditions for optimizing and stabilizing production of the antibiotic secreted by ZA1. The results showed that the optimum culture medium for ZA1 consisted of 200 g potato, 10 g peptone, 20 g sucrose and 1000 mL distilled water. The optimum fermentation temperature of ZA1 was 17.8℃.The optimum pH value of ZA1’s culture medium was 6.9. The optimum 150 mL triangle bottle volume of ZA1 was 20 mL. The optimum culture mode of ZA1 was shaking cultivation in the dark for 96 hours. Results showed that the EC50=0.1228 μL/mL against P. foveata after optimization was 37 times higher than the EC50=4.5888 μL/mL against P. foveata before optimization. Crude extracting of bacteriostatic from ZA1 showed that the characteristics of high temperature resistance and relative activity could reach 76.62% after it was treated at 90℃ for 2 hours. Relative activity was stable and could not be destroyed under UV irradiation for 30 minutes. The bacteriostatic extract of ZA1 had good acid and alkali resistance. When it was treated by pH=3 and pH=11, the relative activity was 92.87% and 85.11% respectively. It was not sensitive to protease and heavy metal ions such as Ag+, Cu2+, Zn2+and Fe3+. Relative activity remained at 86.93% after Ag+treatment.

Key words:Polygonum viviparum endophytic bacteria; Bacillus mojavensis; antagonistic substances; condition of culture; stability

微生物資源作為除動物和植物之外的第三類生物資源，而生防菌資源是微生物資源中的一類重要生物資源，隨著綠色農(nóng)業(yè)的深入推廣，利用微生物源農(nóng)藥對植物病害進行防治的研究成為了熱點。目前，除所推測的太空微生物資源未見生防菌報道之外，其他微生物資源如植物內(nèi)生菌、土壤微生物、極端環(huán)境微生物、濕地微生物、海洋微生物及動物腸道和糞便菌均有生防菌的報道[1]，且從植物和土壤中分離得到了拮抗細菌、真菌、放線菌等拮抗微生物的報道較多[2-8]。近年來，對生防菌抑菌機制的研究和明確其抑菌物質(zhì)的種類更是受到了眾多學者的青睞。研究表明，芽孢桿菌可以通過其核糖體途徑產(chǎn)生某些細菌素和酶類及活性蛋白質(zhì)類物質(zhì)來溶解病原菌的細胞壁，也可以通過非核糖體途徑產(chǎn)生的抗菌肽、脂肽物質(zhì)或抗菌素通過鋅離子通道或其他機制作用于病原菌的細胞膜[9-12]。隨著研究的不斷深入，學者報道了許多胞外分泌型抑菌蛋白[10]、抑菌酶[13]、抗生素[14]，其中，多數(shù)抑菌物質(zhì)制劑已用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)當中；近年來，學者更是借助超濾杯及小分子分離柱等分離得到具有抑菌作用的小分子抗菌肽[15-17]，這些抗菌肽的結(jié)構(gòu)一般為環(huán)形或線形，且其一般具有耐高溫和耐蛋白酶的特性，對酸堿和紫外線穩(wěn)定[18-19]。

馬鈴薯(Solanumtuberosum)是世界第四大糧食作物，在甘肅種植面積較大，近年來馬鈴薯貯藏期病害發(fā)生嚴重，其中以我國檢疫病害馬鈴薯壞疽病菌(Phomafoveata)最為嚴重，可在馬鈴薯的貯藏期造成大量腐爛[20]。馬鈴薯貯藏期長達4至5個月，且溫度低，在此期間不便施用化學藥劑防治，但從東祁連山高寒草地珠芽蓼(Polygonumviviparum)中分離得到的內(nèi)生細菌莫海威芽孢桿菌ZA1(Bacillusmojavensis)對馬鈴薯壞疽病菌的抑制效果明顯，且其對馬鈴薯其他貯藏期病害如馬鈴薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)、褐腐病菌(Stysanusstemonitis)、干腐病菌(Fusariumoxysporum)和早疫病菌(Alternariasolani)亦有較好的抑制效果[21]。因此，本試驗研究了莫海威芽孢桿菌ZA1抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性，并優(yōu)化了培養(yǎng)條件，以期為ZA1研發(fā)成為微生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1　供試菌株

馬鈴薯壞疽病菌為供試病原菌；高寒草地珠芽蓼內(nèi)生細菌，菌株編號為ZA1，為供試拮抗菌，菌種均由甘肅農(nóng)業(yè)大學植物病理實驗室提供。

1.2　培養(yǎng)基

供試培養(yǎng)基為PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)、NA(牛肉胨培養(yǎng)基)和NB(牛肉胨培養(yǎng)液)[22]。

1.3　無菌液的提取

將菌株ZA1在NA斜面培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)24 h，用無菌水配制懸浮液，接種于NA培養(yǎng)液中，裝液量為40 mL/150 mL，搖床培養(yǎng)24 h，即得發(fā)酵液，取發(fā)酵原液2 mL接種于NB培養(yǎng)液中搖床培養(yǎng)24 h，所得發(fā)酵液在轉(zhuǎn)速8000 r/min下離心20 min，取上清液用細菌過濾器(孔徑0.22 μm)過濾活菌體，即獲得菌株ZA1的無菌液，4℃下保存待用，用于研究優(yōu)化產(chǎn)抑菌物質(zhì)的條件和穩(wěn)定測定。

1.4　ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)最佳條件的優(yōu)化

ZA1培養(yǎng)基，以PDA、NA培養(yǎng)基分別用于壞疽病菌和拮抗菌的活化；A、B、C、D、E、F、G、H等8種培養(yǎng)液用于研究其對抗菌物質(zhì)產(chǎn)生的影響。各配方如下：

A：牛肉胨5.0 g、蛋白胨10 g、蔗糖20 g、水1000 mL；

B：馬鈴薯200 g、蛋白胨10 g、蔗糖20 g、水1000 mL；

C(NB)：牛肉胨3 g、蛋白胨5.0 g、葡萄糖2.5 g、水1000 mL；

D(NYDA)：牛肉胨8 g、酵母浸膏5.0 g、葡萄糖10 g、水1000 mL；

E：玉米淀粉2.5 g、(NH4)2SO410 g、蔗糖10 g、水1000 mL；

F：玉米淀粉3.0 g、(NH4)2SO410 g、KH2PO415 g、蔗糖10 g、水1000 mL；

G：5×M9, Na2HPO464 g、KH2PO415 g、NaCl 2.5 g、NH4Cl 5.0 g、水1000 mL，取5×M920 mL定容至1000 mL；

H：蛋白胨10 g、酵母浸膏5.0 g、NaCl 10 g、水1000 mL。

將各培養(yǎng)液pH調(diào)至7.0，取40 mL培養(yǎng)液裝入150 mL三角瓶中，滅菌后分別接入2 mL 拮抗菌原液，每處理3瓶，將各處理置于26~28℃、150 r/min的搖床上分別培養(yǎng) 24 h后制備無菌液，并制成濃度為80 μL/mL的含藥平板，以無菌水為對照，測定抑制率，確定拮抗菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的最佳培養(yǎng)基。

溫度，設(15±1)℃，(20±1)℃，(25±1)℃，(30±1)℃，(35±1)℃，(40±1)℃，(45±1)℃等7個溫度處理，3次重復，其他培養(yǎng)條件及測定方法同上。

pH， 培養(yǎng)基pH值分別設置3，4，5，6，7，8，9，10和11(用pH-HJ90B酸度計測定)，其他培養(yǎng)條件及測定方法同上。

相對供氧量，在150 mL三角瓶中分裝20，40，60，80和100 mL NB培養(yǎng)液，將ZA1原液與NB培養(yǎng)液按1∶20的比例接菌，重復3次，其他培養(yǎng)條件及測定方法同上。

培養(yǎng)方式，設置靜止，間歇振(12 h/d)，全天24 h振蕩3個處理(振速150 r/min)，其他培養(yǎng)條件及測定方法同上。

光照，設置24，12 h/d光照和24 h/d黑暗3個處理，其他培養(yǎng)條件及測定方法同上。

發(fā)酵時間，分別培養(yǎng)24，48，72，96，120，144 和168 h后，利用無菌液與PDA混合制成濃度25 μL/mL的含藥平板測定抑菌率，明確抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生與培養(yǎng)時間的關系。

ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)最佳條件的驗證，優(yōu)化前(25℃于pH為7.0的NB培養(yǎng)基中光照振蕩培養(yǎng)48 h，150 mL三角瓶裝液量為40 mL)，制備濃度依次為6.25，12.5，25，50和100 μL/mL含藥平板，以加無菌水為對照。經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)后，制備濃度為3.125，6.25，12.5，25和50 μL/mL 的含藥平板，計算抑菌率和EC50。

1.5　ZA1抑菌粗提物穩(wěn)定性的測定

熱穩(wěn)定性的測定：將ZA1的無菌液分別置于20，30，40，50，60，70，80，90和100℃水浴處理2 h及120℃滅菌2 h，取處理液2 mL配制含藥平板，采用十字交叉法測定抑制率。

UV穩(wěn)定性測定：將ZA1 無菌液分別置于2 mL離心管，進行0，5，10，15，20，25，30 min的UV照射，后制成濃度為1.25 μL/mL的含藥平板，采用十字交叉法測定抑制率。

pH穩(wěn)定性測定：將ZA1無菌液的pH分別調(diào)至3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0和11.0， 4℃下保存24 h，其他方法同上。

對金屬離子的穩(wěn)定性測定：在無菌液中分別加入Na+，Mg2+，Cu2+，Mn2+，Zn2+，F(xiàn)e3+和Ag+，使終濃度為10 mmol/L，混勻反應2 h后，以無菌液平板和各離子平板為對照，其他方法同上。

對蛋白酶的穩(wěn)定性測定：于ZA1的無菌液中分別加入蛋白酶K和胰蛋白酶，使胰蛋白酶的終濃度依次為32，16，8，4，2和0 mg/mL，蛋白酶K 的終濃度依次為40，20，10，5，2.5和0 mg/mL，37℃下反應4 h后，制成濃度為20 μL/mL的含藥平板，以無菌液平板為對照，其他方法同上。

1.6　數(shù)據(jù)處理

應用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1　ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)最佳條件的優(yōu)化

2.1.1不同培養(yǎng)基對ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響ZA1在A，B和D培養(yǎng)液中所產(chǎn)生抑菌物對馬鈴薯壞疽病的抑制率分別達80.01%，82.99%和79.56%(圖1)，顯著高于其他培養(yǎng)液(P<0.01)，在C和H培養(yǎng)液中所產(chǎn)生抑菌物對馬鈴薯壞疽病的抑制率分別是69.79%和53.49%，其他培養(yǎng)液中所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對該病菌的抑制率均未達到10%，說明不同培養(yǎng)液對ZA1產(chǎn)抑菌物質(zhì)的量有影響， ZA1最佳培養(yǎng)基為B培養(yǎng)液(馬鈴薯200 g、蛋白胨10 g、蔗糖20 g、水1000 mL)。

圖1　培養(yǎng)液對ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響Fig.1　Effect of ZA1 culture filtrates from different media on growth of P. foveata

2.1.2溫度對ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響結(jié)果表明，在20℃時，ZA1所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對馬鈴薯壞疽病的抑制率達到了88.50%，通過對溫度與抑制率的相關性分析，擬合得到了六次回歸曲線(圖2)：Y=8.222X-0.006X3+2.598×10-8X6-47.107，相關系數(shù)R=0.937**，求得ZA1產(chǎn)抑菌物質(zhì)的最佳溫度為17.8℃。

圖2　溫度對ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響Fig.2　Effect of ZA1 culture filtrates from different temperature on growth of P. foveata

不同字母表示差異顯著，小寫：P<0.05；大寫：P<0.01。下同。 Different capital and small letters are significantly different at 0.05 and 0.01 level. The same below.

2.1.3pH對ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響當培養(yǎng)液的pH為7時，ZA1對馬鈴薯壞疽病的抑制率達到了82.16%，通過相關性分析，擬合得到了六次回歸曲線(圖3)：Y=41.524X-0.397X3+3×10-3X6-90.989，相關系數(shù)R=0.988**，根據(jù)曲線方程求得ZA1的產(chǎn)抑菌物質(zhì)最佳的pH為6.9，表明中性條件下有利于ZA1抑菌物質(zhì)的積累。

圖3　pH對ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響Fig.3　Effect of ZA1 culture filtrates from different pH on growth of P. foveata

2.1.4相對供氧量對ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響150 mL三角瓶裝液量為20 mL時，ZA1對馬鈴薯壞疽病的抑制率為72.23%，通過相關性分析，擬合得到了五次回歸曲線(圖4)：Y=89.349-1.292X+9.261×10-5X3-3.863×10-9X5，相關系數(shù)R=0.981**，求得ZA1的產(chǎn)抑菌物質(zhì)最佳的裝液量為150 mL三角瓶裝20 mL。

圖4　相對供氧量對ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響Fig.4　Effect of ZA1 culture filtrates from different oxygen supply on growth of P. foveata

2.1.5培養(yǎng)方式對ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響ZA1以振動的方式培養(yǎng)時，分泌抑菌物質(zhì)最多，其對馬鈴薯壞疽病的抑制率可達76.56%，顯著高于只振動培養(yǎng)12 h得到的抑制率68.75%和靜置培養(yǎng)24 h得到的抑制率46.16%(表1)，說明ZA1的最佳培養(yǎng)方式為全過程振動培養(yǎng)。

2.1.6光照時間對ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響全黑暗培養(yǎng)所得的無菌液對馬鈴薯壞疽病的抑制率為69.83%(表1)，顯著高于12和24 h光照的抑制率，說明黑暗培養(yǎng)下培養(yǎng)ZA1，有利于抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生。

2.1.7發(fā)酵時間對ZA1產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響ZA1經(jīng)96 h的培養(yǎng)所得到的無菌液抑制率與經(jīng)過120，144和168 h培養(yǎng)得到的無菌液抑制效果差異不顯著，抑制率均達到87.6%以上(圖5)，說明ZA1培養(yǎng)到96 h后抑菌物質(zhì)不再隨培養(yǎng)時間的增加而增加。

2.1.8ZA1產(chǎn)抑菌物質(zhì)最佳條件的驗證生長速率法測定對馬鈴薯壞疽病的抑制率表明，抑制率與不同濃度的無菌液之間呈正相關，所得回歸直線的R=0.995**，差異極顯著，根據(jù)回歸直線求得ZA1無菌液的EC50=4.588 μL/mL(表2)。 按照最佳條件進行培養(yǎng)(最佳培養(yǎng)液：B培養(yǎng)液,馬鈴薯200 g，蛋白胨10 g，蔗糖20 g，水1000 mL；最佳培養(yǎng)溫度：17.8℃；最佳pH：6.3；150 mL三角瓶的最佳裝液量20 mL；最佳培養(yǎng)方式：96 h暗處理振動培養(yǎng))。所得的回歸直線R=0.997**，其EC50=0.1228 μL/mL，優(yōu)化后的EC50比優(yōu)化前小37倍，差異極顯著，說明條件優(yōu)化后，對ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的能力有較大的提高。

圖5　培養(yǎng)時間對ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響Fig.5　Effect of ZA1 culture filtrates from different culture time on growth of P. foveata

表1　不同培養(yǎng)方式對ZA1產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響

注：不同字母表示差異顯著，小寫：P<0.05；大寫：P<0.01。下同。

Note: Different capital and small letters are significantly different at 0.05 and 0.01 level. The same below.2.2ZA1抑菌粗提物的穩(wěn)定性測定

2.2.1熱穩(wěn)定性測定ZA1無菌液在90℃時，其相對活性達到76.62%(表3)，表明ZA1抑菌活性物質(zhì)具有耐高溫的性質(zhì)，當溫度達到和超過100℃后，其相對活性迅速下降，但沒有完全喪失，說明ZA1的大多數(shù)抑菌活性物質(zhì)不耐100℃及以上的高溫。

2.2.2對pH的穩(wěn)定性測定無菌液在pH為3和11時，相對活性達到92.87%和85.11%(表4)，對馬鈴薯壞疽病菌的抑制率在50%以上，說明ZA1分泌的抑菌物質(zhì)耐酸堿。

2.2.3對UV的穩(wěn)定性測定無菌液經(jīng)UV照射后，其相對活性均在96%以上，差異不顯著(P>0.05)(表5)，說明ZA1的抑菌物質(zhì)對UV具有穩(wěn)定性。

2.2.4對金屬離子的穩(wěn)定性測定抑菌粗提物對Na+，Mg2+和Mn2+不敏感，相對活性沒有變化，對Zn2+，Cu2+，F(xiàn)e3+和Ag+等重金屬離子較為敏感，相對活性有所下降，其中對Ag+最為敏感，但是抑制率仍可達到77.82%(表6)，其相對活性下降極顯著，但下降幅度不超過15%。說明ZA1的抑菌物質(zhì)對Ag+，Cu2+，Zn2+，F(xiàn)e3+等金屬離子不太穩(wěn)定，對其他金屬離子均具有穩(wěn)定性。

表2　ZA1的無菌液對馬鈴薯壞疽病菌的抑制作用

表3　ZA1無菌液的熱穩(wěn)定性

表4　ZA1的無菌液對pH的穩(wěn)定性

表5　ZA1無菌液的UV穩(wěn)定性

表6　ZA1的無菌液對金屬離子的穩(wěn)定性

2.2.5對蛋白酶的穩(wěn)定性測定無菌液經(jīng)不同濃度的蛋白酶K處理后，抑制率和相對活性在P<0.01水平差異不顯著；經(jīng)不同濃度的胰蛋白酶處理后，抑制率和相對活性均差異顯著(表7)，說明ZA1分泌的抑菌物質(zhì)對胰蛋白酶較為敏感，即ZA1所分泌的抑菌物質(zhì)中存在抑菌蛋白。

3討論

近年來，隨著對抑菌機制的不斷研究，邢介帥等[10]分離得到的T2可分泌胞外蛋白酶，古麗皮艷等[23]分離得到的NKZ-E能夠分泌幾丁質(zhì)酶；高芬等[17]、連玲麗等[24]純化得到了具有良好穩(wěn)定性的抗菌多肽。說明拮抗細菌主要以胞外分泌型物質(zhì)抑制病原菌的生長，劉雪等[11]認為這類物質(zhì)主要有兩種類型：大分子的抑菌蛋白和小分子肽類。ZA1(B.mojavensis)的無菌液對馬鈴薯壞疽病菌的EC50=0.1228 μL/mL，拮抗效果明顯，說明ZA1的抑菌物質(zhì)主要是胞外分泌型物質(zhì)。其抑菌粗提物可耐高溫、耐酸堿、對紫外線穩(wěn)定、且對蛋白酶的耐受性穩(wěn)定，這與王建綱等[25]認為抗菌肽具有的特性一致，說明ZA1可能能夠分泌抗菌肽，但對抗菌肽的分離、純化及結(jié)構(gòu)還需進一步研究。ZA1的抑菌粗提物在90℃處理2 h后，相對活性穩(wěn)定在76.67%，但是100℃下處理2 h后抑菌活性直線下降，說明ZA1也可能產(chǎn)生一些大分子的抑菌蛋白，隨著溫度的升高活性降低。由ZA1抑菌粗提物的種種性質(zhì)推測其可能也會分泌一些大分子量抑菌蛋白和小分子量的抗菌肽。除此之外， 120℃處理無菌液2 h后，相對活性仍達23.34%，說明ZA1胞外分泌的抑菌物質(zhì)中含有耐高溫的抑菌物質(zhì)，此還需進一步的研究。

表7　ZA1的無菌液對蛋白酶的穩(wěn)定性

ZA1對馬鈴薯壞疽病菌等馬鈴薯貯藏期的病原菌具有良好的抑制效果，本試驗優(yōu)化得到了ZA1的分泌抑菌物質(zhì)最佳的培養(yǎng)條件，培養(yǎng)條件與常規(guī)培養(yǎng)稍有差異，但其積累抑菌物質(zhì)的最佳培養(yǎng)溫度為17.8℃，這與常規(guī)培養(yǎng)存在較大差異，明顯低于李晶等[26]、趙瑞等[27]對枯草芽孢桿菌TU100和B29產(chǎn)抑菌物質(zhì)的最佳溫度。由于ZA1是高寒草地珠芽蓼內(nèi)生菌，其特殊的生境可能是導致差異存在的原因，究其具體原因還需進一步研究。通過優(yōu)化ZA1產(chǎn)抑菌物質(zhì)的條件及對抑菌粗提物抑菌活性的初步研究，為ZA1的小試、中試提供技術支持。

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通訊作者*Corresponding author.

作者簡介：楊成德(1975-),男,甘肅隴南人，博士。E-mail:yangcd@gsau.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金(No.31160122)和草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室(甘肅農(nóng)業(yè)大學)開放課題項目(No.CYzs-2011011)資助。

收稿日期：2014-03-04；改回日期：2014-04-21

DOI：10.11686/cyxb2014086http://cyxb.lzu.edu.cn