王　華，張浩軍，趙婷婷，嚴美花，董　晞，孫斯凡，張并璇，李　平

(1.中國醫(yī)學科學院﹠北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京　100730；2.中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所，北京　100029)

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糖尿病腎病ETFβ表達變化與脂毒性關(guān)系研究

王華1,2，張浩軍2，趙婷婷2，嚴美花2，董晞2，孫斯凡1,2，張并璇2，李平1,2

(1.中國醫(yī)學科學院﹠北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京100730；2.中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所，北京100029)

【摘要】目的通過檢測ETFβ在糖尿病腎病中的改變，探討其與脂毒性的關(guān)系。 方法 體內(nèi)實驗采用腹腔注射鏈脲佐菌素合并單側(cè)腎切除建立糖尿病腎病模型，并評價腎小管損傷情況，檢測ETFβ在腎皮質(zhì)中的表達變化。體外建立脂肪酸誘導腎小管細胞NRK 52E凋亡模型，構(gòu)建ETFβ重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染至NRK 52E細胞，觀察ETFβ過表達對脂肪酸誘導細胞凋亡的作用。 結(jié)果 鏈脲佐菌素合并單側(cè)腎切除誘導的糖尿病腎病大鼠模型中，腎小管明顯損傷，ETFβ mRNA 和蛋白表達均下降。脂肪酸可誘導NRK 52E細胞凋亡，過表達ETFβ可減少凋亡。 結(jié)論 糖尿病腎病模型中ETFβ表達下降，過表達ETFβ可降低脂肪酸誘導的腎小管細胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】ETFβ；糖尿病腎病；脂肪酸；凋亡

糖尿病腎病發(fā)病機制復雜，具體機制尚未闡明清楚。本課題組前期蛋白組學發(fā)現(xiàn)電子轉(zhuǎn)運黃素蛋白 β 亞單位(electron transfer flavoprotein β subunit，ETFβ)在2型自發(fā)性糖尿病腎病 OLETF 大鼠模型中發(fā)生了氨基酸突變(未發(fā)表)，但 ETFβ是否參與糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展目前未見報道。ETF由 α 和 β 亞單位組成，是一種含有黃素核苷酸輔基的電子載體蛋白，存在于生物體細胞線粒體內(nèi)，接受上游脂肪酸氧化脫氫反應產(chǎn)生的電子，然后在輔基 FAD 的幫助下傳遞給電子轉(zhuǎn)運黃素蛋白泛醌氧化還原酶(electron transfer flavoprotein ubiquinone oxidoreductase，ETF：QO)，通過輔酶Q10(Coenzyme Q10，CoQ10)而進入呼吸鏈，最終與氧結(jié)合生成水[1-2]。ETF作為脂肪酸氧化第一步反應的電子接受體，其在糖尿病腎病脂代謝紊亂中是否發(fā)揮重要作用尚無明確報道。本研究旨在通過檢測ETFβ在糖尿病腎病中的改變，探討其可能的作用機制，為進一步揭示糖尿病腎病脂毒性的機制及提供藥物作用的新靶點打下基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1實驗動物

雄性Wistar大鼠16只，8周齡，體重160～200 g，分為假手術(shù)組(Sham)和糖尿病腎病模型組(DN)，每組8只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2009-0007】，飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床研究所SPF級動物室【SYXK(京)2010-0011】。

1.2試劑

鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)。NRK 52E細胞、綠色熒光蛋白(GFP)為中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所藥理室保存；真核表達載體pcDNA3.1/V5-His、新型pUC-T快速克隆試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)；高保真PCR擴增試劑盒(德國Roche公司)；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Eco R V、Pst I、Xba I(美國 New England Biolabs公司)；凝膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒中提試劑盒(德國 QIAGEN公司)。抗V5單克隆抗體(美國Invitrogen公司),抗ETFβ多克隆抗體(中國Proteinteck公司)。lip2000(美國 Invitrogen公司)，棕櫚酸鈉(palmitate，PA)、無脂肪酸-BSA(美國sigma)。TUNEL檢測試劑盒(德國Roche公司)。

1.3糖尿病腎病大鼠模型的建立

通過腹腔注射鏈脲佐菌素合并單側(cè)腎切除建立糖尿病腎病大鼠模型[3-4]。大鼠購入后順應性喂養(yǎng)一周，測定血糖和尿蛋白等基礎(chǔ)狀態(tài)，將血糖偏高的1只大鼠剔除，其余動物按體重隨機分為假手術(shù)組和模型組。腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，右側(cè)背部術(shù)前備皮，常規(guī)消毒，背部切口1 cm 左右以充分暴露右腎，假手術(shù)組剝離腎臟包膜，縫合切口。模型組大鼠結(jié)扎右腎門血管，切除右腎，縫合傷口。術(shù)后1周，手術(shù)組以40 mg/kg的劑量腹腔注射1%鏈脲佐菌素，假手術(shù)組注射相同劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。3 d后大鼠禁食不禁水12 h，測空腹血糖，高于16.7 mmol/L作為糖尿病模型成功建立的標準，記為“0周”時間點。連續(xù)觀察20周，檢測到大量蛋白尿，視為糖尿病腎病模型建立。

1.4ETFβ 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

以大鼠ETFβ mRNA序列設(shè)計引物以擴增出該基因的全長，分別在上、下游引物前加上EcoR V、Xba I酶切位點，應用高保真酶和RT-PCR方法擴增出編碼ETFβ的cDNA，將PCR產(chǎn)物回收純化并驗證其分子量。將PCR產(chǎn)物克隆至pUC-T載體，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞,篩選陽性菌落并擴增，進行質(zhì)粒抽提,經(jīng)酶切鑒定并進行測序證實為ETFβ基因序列后，ETFβ/pUC-T和pcDNA3.1/V5-His載體分別用EcoR V和Xba I進行雙酶切，用T4 DNA連接酶連接雙酶切后的目的片段和載體，構(gòu)建ETFβ/ pcDNA3.1/V5-His重組質(zhì)粒(簡稱ETFβ重組質(zhì)粒)。將NRK 52E細胞接種于6孔板，細胞貼壁后采用脂質(zhì)體lip2000轉(zhuǎn)染ETFβ重組質(zhì)粒，同時轉(zhuǎn)染GFP作為轉(zhuǎn)染效率參照物，轉(zhuǎn)染48 h后倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。對照組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/V5-His空載體，轉(zhuǎn)染ETFβ重組質(zhì)粒48 h后收細胞提取蛋白質(zhì)，用于檢測V5標簽融合蛋白的表達。以 BSA為載體溶解PA,儲液濃度為5 mmol/L。轉(zhuǎn)染24 h后，PA組和重組質(zhì)粒組加入終濃度為0.5 mmol/L的PA，對照組加入等體積的BSA，再過24 h后用TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡情況。

1.5統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)用均數(shù)+標準差表示，兩樣本均數(shù)比較用獨立樣本t檢驗，P< 0.05視為有統(tǒng)計學差異。

2結(jié)果

2.1糖尿病腎病大鼠的脂代謝異常和腎小管損傷評價

腹腔注射鏈脲佐菌素合并單側(cè)腎切除建立的糖尿病腎病模型組大鼠隨著血糖持續(xù)性升高，一般情況較差：模型組大鼠出現(xiàn)食量和飲水量增加，毛發(fā)散亂、無光澤，尿量增加，活動減少。

注：A：血糖；B：24 h 尿蛋白；C：血脂。與假手術(shù)組比較， **P < 0.01。圖1　兩組大鼠的血糖、24 h蛋白尿和血脂情況Note: A. blood glucose; B. 24 h urinary protein; C. blood lipids. Compared with the sham group, **P < 0.01.Fig.1　Comparison of blood glucose, 24 h urinary protein and blood lipids between Sham and DN groups

在切除單側(cè)腎臟1周時，腹腔注射鏈脲佐菌素3 d后，大鼠的血糖明顯高于假手術(shù)組，且該組大鼠20周后仍然維持較高的血糖水平(圖1A)。在糖尿病模型建立，即0周時，糖尿病腎病組大鼠的尿蛋白很低，與假手術(shù)組無差異，但血糖持續(xù)升高20周后，該組大鼠出現(xiàn)大量尿蛋白，糖尿病腎病模型建立成功(圖1B)。與此同時，發(fā)現(xiàn)血糖升高20周后糖尿病腎病大鼠出現(xiàn)血甘油三酯和總膽固醇的明顯升高(圖1C)。 糖尿病腎病大鼠與假手術(shù)組在腎小管PAS染色上有明顯形態(tài)學差異，假手術(shù)組腎小管結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，間質(zhì)無炎癥和纖維化；DN組大鼠腎小管上皮細胞出現(xiàn)玻璃滴樣變和空泡變性，此外，部分腎小管擴張或萎縮，管腔內(nèi)可見蛋白樣物質(zhì)或蛋白管型，部分間質(zhì)可見散在的淋巴細胞和單核細胞浸潤及纖維化(彩插1圖2A)。半定量[5]分析結(jié)果顯示腎小管損傷指數(shù)在兩組之間具有統(tǒng)計學差異(彩插1圖2B)。

2.2糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)ETFβ的差異性表達

注：A: ETFβ mRNA水平的變化；B: ETFβ 蛋白水平的變化。與假手術(shù)組比較， **P < 0.01。圖3　糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)ETFβ的差異性表達Note: A. the relative expression of ETFβ mRNA; B. the relative expression of ETFβ protein. Compared with the sham group, **P < 0.01.Fig.3　The expression of ETFβ in the kidney cortex of diabetic nephropathy rats compared with control rats

通過以上方法建立的糖尿病腎病模型，大鼠出現(xiàn)大量蛋白尿時取材，提取腎皮質(zhì)的RNA 和蛋白，分別通過real time PCR和western blot檢測發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)中的ETFβ在mRNA(圖3A)和蛋白水平(圖3B)均出現(xiàn)表達量的下降。2.3ETFβ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的觀察和正確表達的鑒定

為觀察ETFβ重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，將綠色熒光蛋白GFP的質(zhì)粒以相同條件轉(zhuǎn)染至NRK 52E細胞，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)有較高的轉(zhuǎn)染效率(彩插2圖4A)。為進一步驗證ETFβ重組質(zhì)粒的成功構(gòu)建，轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞提取蛋白，用V5抗體通過western blot檢測融合蛋白的表達，空載體組未見目的蛋白表達，ETFβ重組質(zhì)粒能在NRK 52E細胞中正確表達(彩插2圖4B)。

2.4ETFβ過表達對PA誘導NRK 52E凋亡的影響

0.5 mmol/L PA刺激NRK 52E 細胞24 h出現(xiàn)明顯凋亡。轉(zhuǎn)染ETFβ重組質(zhì)粒24 h后，再加入PA，與對照組比較，TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)凋亡率明顯下降(彩插2圖5A)。半定量分析表明ETFβ過表達能夠明顯降低PA誘導的NRK 52E細胞的凋亡(彩插2圖5B)。

3討論

大劑量注射STZ(40 mg/kg)可導致胰腺分泌胰島素功能嚴重受損，出現(xiàn)類似臨床糖尿病癥狀，合并單側(cè)腎切除后可以縮短誘發(fā)糖尿病腎病的周期。本研究通過該方法建立的糖尿病腎病模型在觀察20周時即出現(xiàn)大量蛋白尿，且血糖在整個試驗周期內(nèi)均高于16.7 mmol/L。此外，在該模型中觀察到血甘油三酯和總膽固醇的升高，與文獻報道[6]的第四周即開始出現(xiàn)血脂代謝異常的結(jié)果一致。糖尿病脂代謝紊亂在并發(fā)癥中所起的作用越來越受到重視，2001年第61屆美國糖尿病學會年會上，Banting科學成就獎得主McGarry教授指出，脂肪酸代謝障礙是糖尿病及其并發(fā)癥的原發(fā)病理生理改變。其中游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)增高導致的脂毒性既是糖尿病患者發(fā)病的可能病因之一，同時也是脂代謝紊亂的特征之一。主鏈超過15個碳的長鏈脂肪酸有細胞毒性，不同飽和態(tài)的脂肪酸毒性強弱、作用途徑和方式不同[7]。PA是糖尿病和代謝綜合征患者血循環(huán)中FFA的主要存在形式，已被證明與包括細胞凋亡在內(nèi)的腎小管細胞損傷等有關(guān)[8]。本研究建立的糖尿病腎病模型在第20周時觀察到腎小管萎縮等嚴重受損情況，但其發(fā)病機制中是否和脂代謝異常有直接關(guān)系尚不清楚。

本研究中觀察到脂代謝異常和腎小管損傷的同時，檢測到大鼠腎皮質(zhì)中ETFβ的基因和蛋白表達均明顯降低。目前ETFβ與疾病相關(guān)的研究主要集中在脂質(zhì)沉積性肌病，如編碼ETF的基因ETFa和/或ETFβ突變可引起該疾病發(fā)生。有研究表明，2型糖尿病模型db/db小鼠的心臟線粒體蛋白組學發(fā)現(xiàn)ETFa表達量增加5.9倍，但綜合相關(guān)蛋白的表達情況分析，綜合來看，隨著糖尿病表型的持續(xù)長期存在，ETFa將會下調(diào)[9]。但ETFβ是否參與糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展，其扮演的角色和作用機制目前尚不清楚。在正常培養(yǎng)的腎小管上皮細胞NRK 52E培養(yǎng)基中加入0.5 mmol/L PA，TUNEL法檢測結(jié)果顯示細胞出現(xiàn)明顯凋亡。轉(zhuǎn)染ETFβ重組質(zhì)粒后再加入PA刺激細胞，發(fā)現(xiàn)ETFβ過表達能夠降低PA誘導的腎小管上皮細胞的凋亡，綜合體內(nèi)實驗結(jié)果糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)ETFβ表達的下降來看，ETFβ在脂毒性誘導的細胞凋亡中可能發(fā)揮一定的保護作用。

以上體內(nèi)外實驗結(jié)果提示ETFβ在糖尿病腎病大鼠腎小管損傷時表達下降，過表達ETFβ能夠減少飽和脂肪酸PA誘導的腎小管上皮細胞的凋亡。該實驗發(fā)現(xiàn)為糖尿病腎病的機制研究提供部分證據(jù)，但ETFβ的具體作用機制尚需進一步研究，為開發(fā)治療糖尿病腎病的有效藥物提供新的方向。

參考文獻：

[1]Rhein V F, Carroll J, He J,etal. Human METTL20 methylates lysine residues adjacent to the recognition loop of the electron transfer flavoprotein in mitochondria [J]. Journal of Biological Chemistry, 2014, 289(35): 24640-24651.

[2]Rodrigues J V, Gomes C M. Mechanism of superoxide and hydrogen peroxide generation by human electron-transfer flavoprotein and pathological variants [J]. Free Radical Biology and Medicine, 2012, 53(1): 12-19.

[3]Zhao T, Zhang H, Zhao TT,etal. Intrarenal metabolomics reveals the association of local organic toxins with the progression of diabetic kidney disease [J]. J Pharm Biomed Anal, 2012, 23(60):32-43.

[4]吳凡，龔超，陳志遠，等．肉桂提出物甲基查爾斯多酮對單側(cè)腎切除糖尿病大鼠腎臟損害的保護作用[J]．中華實驗外科雜志，2009，26(11)：1515-1518.

[5]Meng XM, Huang XR, Xiao J,etal. Diverse roles of TGF-β receptor II in renal fibrosis and inflammation in vivo and in vitro [J]. J Pathol, 2012, 227: 175-188.

[6]張麗芬，呂仁和，黃文政. 鏈脲佐菌素糖尿病腎病大鼠模型的建立及穩(wěn)定性評價[J].中國比較醫(yī)學雜志，2014,24(4)：8-12.

[7]Maedler K, Spinas GA,Dyntar D,etal. Distinct effects of saturated and monounsaturated fatty acid on β-cell turnover and function [J]. Diabetes, 2001, 50: 69-76．

[8]Soumura M, Kume S, Isshiki K,etal. Oleate and eicosapentaenoic acid attenuate palmitate-induced inflammation and apoptosis in renal proximal tubular cell [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010; 402: 265-271.

[9]MF ESSOP, WA CHAN, S HATTINGH. Proteomic analysis of mitochondrial proteins in a mouse model of type 2 diabetesb[J]. Cardiovasc J Afr, 2011, 22: 175-178.

〔修回日期〕2015-03-31

研究報告

Study on the expression of ETFβ in diabetic nephropathy and its

relationship with lipotoxicity

WANG Hua1,2，ZHANG Hao-jun2，ZHAO Ting-ting2，YAN Meihua2，DONG Xi2，SUN Si-fan1,2，ZHANG Bing-xuan2，LI Ping1,2

(1. Graduate School of Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100730, China;

2. Institute of Clinical Medical Sciences, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China)

【Abstract】ObjectiveTo detect the expression change of ETFβ in diabetic nephropathy rats and study the role of ETFβ in fatty acid-induced apoptosis in renal tubules. Methods Diabetic nephropathy model was established by intraperitoneal injection of streptozotocin and unilateral nephrectomy. In vivo ETFβ expression was detected in renal cortex, as well as tubular injury evaluated. In vitro fatty acid-induced apoptosis in renal tubular cells NRK 52E model was established and ETFβ recombinant plasmid was constructed to be transfected into NRK 52E cells and furtherly to observe the effect of ETFβ over-expression on the fatty acid-induced apoptosis. ResultsIn the rats model of diabetic nephropathy induced by streptozotocin injection and unilateral nephrectomy, ETFβ mRNA and protein expression were decreased as obvious tubular damage occurred. Fatty acids could induce apoptosis in NRK 52E, and ETFβ over-expression reduced the apoptosis. Conclusion The expression of ETFβ is decreased in diabetic nephropathy model , and ETFβ over-expression can reduce apoptosis induced by fatty acid in renal tubular cells.

【Key words】ETFβ；Diabetic nephropathy；Fatty acid；Apoptosis

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.002

【中圖分類號】R332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 05-0005-04

[通訊作者]李平(1956-)，女，研究員，研究方向：中藥防治糖尿病腎病。E-mail： lp8675@163.com。

[作者簡介]王華(1982-)，女，博士生，研究方向：中藥防治糖尿病腎病。

[基金項目]國家自然科學基金(81302942)；國際科技合作項目(2011DFA31860)；國家自然科學基金(81173422)。