杜江濤，戴方偉，周莎桑，宋曉明，呂　宇，薩曉嬰

(1 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 杭州　310013;2 杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 杭州　310036)

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鼠痘病毒熒光定量Taqman-PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

杜江濤1，戴方偉1，周莎桑1，宋曉明2，呂宇1，薩曉嬰1

(1 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 杭州310013;2 杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 杭州310036)

【摘要】目的建立鼠痘病毒的熒光定量Taqman-PCR檢測(cè)方法，以期能快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異的檢出鼠痘病毒。方法經(jīng)過比對(duì)和篩選，本研究選取鼠痘病毒的ERPV027基因480-800位序列段，作為引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物和探針，并對(duì)該引物對(duì)和探針的特異性、靈敏性、穩(wěn)定性和重復(fù)性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果本研究建立的方法，對(duì)鼠痘病毒的檢測(cè)極限是68 copies/μL；該方法特異性強(qiáng)，只對(duì)鼠痘病毒特定片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，而對(duì)小鼠肝炎病毒、仙臺(tái)病毒、沙門氏菌等其它病毒、細(xì)菌無擴(kuò)增；該方法穩(wěn)定性和重復(fù)性均較好。結(jié)論本研究成功建立了檢測(cè)鼠痘病毒的熒光定量Taqman-PCR方法，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，且具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】鼠痘病毒；熒光定量PCR；Taqman探針

鼠痘(mouse pox)是由鼠痘病毒(mouse poxvirus，MPV)感染引起的實(shí)驗(yàn)小鼠的一種烈性傳染病。本病多呈爆發(fā)性流行，致死率較高，常造成全群淘汰，危害極大[1]。臨床表現(xiàn)以四肢、尾和頭部腫脹、潰爛、壞死甚至腳趾脫落為特征，故又稱脫腳病(Ectromelia，Ect)[2]。

目前，鼠痘病毒的檢測(cè)方法主要是酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)和免疫熒光技術(shù)(IFA)[3]等血清學(xué)方法。傳統(tǒng)的血清學(xué)方法對(duì)檢測(cè)鼠痘病毒感染，特別是隱性感染存在較大的局限性。近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)越來越多地應(yīng)用于傳染病的診斷檢測(cè)[4, 5]。關(guān)于鼠痘病毒的普通PCR檢測(cè)方法及應(yīng)用已有報(bào)道[6-8]，但未見其熒光定量PCR檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道。本研究針對(duì)鼠痘病毒建立熒光定量PCR檢測(cè)方法，能快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異的檢出鼠痘病毒。

1材料方法

1.1病毒株核酸及樣品

鼠痘病毒標(biāo)準(zhǔn)株核酸ECT-BJ、ECT-GZ(ECT-GZ-1、ECT-GZ-2)和4個(gè)臨床分離株核酸001、MB35、HZ、1436R由中國食品藥品檢定研究院和廣東實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所提供。種屬外病原核酸包括牛痘病毒、泰澤病原體、仙臺(tái)病毒、小鼠肝炎病毒(以上均來源于中國食品藥品檢定研究院)以及沙門氏菌、李斯特桿菌、支氣管鮑特菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌及42份鼠源性動(dòng)物糞便、組織等樣品(由本實(shí)驗(yàn)室收集保存)。

1.2主要試劑及器材

DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠純化試劑盒購自Qiagen公司；PMD18-T Vector載體、DNA Taq酶、JM109感受態(tài)細(xì)胞、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)相關(guān)試劑購自日本TaKaRa中國分公司；TaqMan Fast Advanced Master Mix購自ABI公司；質(zhì)粒DNA純化試劑盒由Axygen公司生產(chǎn)；DNA Marker、6×Loading Buffer為上海捷瑞產(chǎn)品；常溫離心機(jī)(Thermo)，微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2000-Thermo)，水平電泳儀(Tanon)，Gel Image System(Tanon)，生化培養(yǎng)箱(上海精宏儀器有限公司)，普通PCR擴(kuò)增儀(Bio-RAD)，熒光定量PCR儀(ABI 7500)。

1.3方法

1.3.1引物、探針設(shè)計(jì)及合成：從NCBI上下載鼠痘病毒的全基因組序列，從中選出四個(gè)基因利用Primer Express 3.0設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物對(duì)和探針(表1)。經(jīng)過篩選和驗(yàn)證，本研究最終選取ERPV_027基因作為靶基因引物、探針均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3.2DNA提?。簠⒄誕IAamp DNA Mini Kit說明書，分別提取鼠痘病毒感染樣本、細(xì)菌、鼠源性動(dòng)物糞便組織等樣品的DNA。

1.3.3特異性檢測(cè)：對(duì)設(shè)計(jì)的4對(duì)引物進(jìn)行篩選后，選擇特異性最好的ECT-027引物對(duì)和探針進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)PCR程序進(jìn)行優(yōu)化。

優(yōu)化后的普通PCR體系如下：10× Taq PCR buffer (含Mg2+) 2 μL，dNTPs mixture(2.5 mmol/L)2 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，模板DNA(10 ng/μL) 2 μL，補(bǔ)水至20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s ，共40個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min；8℃保存。

優(yōu)化后的熒光定量Taqman-PCR體系如下：2× TaqMan Fast Advanced Master Mix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，探針(5 μmol/L)1.0 μL，模板DNA(10 ng/μL)1.0 μL，補(bǔ)水至25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃培育2 min，95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s ，預(yù)擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)；95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min ，共40個(gè)循環(huán)，收集熒光信號(hào)并讀取數(shù)據(jù)。

表1　四組熒光定量PCR引物對(duì)和Taqman探針序列

普通PCR和熒光定量Taqman-PCR分別對(duì)鼠痘病毒標(biāo)準(zhǔn)株ECT-BJ、ECT-GZ-1、ECT-GZ-2和分離株001、MB35、1436R、HZ DNA，熒光定量Taqman-PCR對(duì)小鼠肝炎病毒、牛痘病毒、仙臺(tái)病毒、泰澤病原體、沙門氏菌、李斯特菌、支氣管鮑特菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌，及鼠痘病毒感染組織樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)引物和探針的特異性。

1.3.4敏感性檢測(cè):

1.3.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與表達(dá)式的建立:將ERPV_027基因克隆至PMD 18-T vector上，并對(duì)重組質(zhì)粒(21.7 ng/μL)依次作10倍稀釋直到21.7×10-8ng/μL。選取(21.7×10-8~21.71×10-1)ng/μL進(jìn)行TaqMan探針檢測(cè)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.2探針靈敏性: 將重組質(zhì)粒(21.7 ng/μL)依次作10倍稀釋直到21.7× 10-9ng/μL，再取1 μL各稀釋倍數(shù)的ERPV_027克隆質(zhì)粒作為模板，用熒光定量Taqman-PCR進(jìn)行檢測(cè)，PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序同上。

1.3.5穩(wěn)定性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn):取鼠痘病毒標(biāo)準(zhǔn)株ECT-BJ、ECT-GZ-1、ECT-GZ-2，分離株001、MB35、1436R、HZ DNA及同一批PCR檢測(cè)試劑于-20℃冰箱放置1周、2周、3周，用熒光定量Taqman-PCR檢測(cè)，3次試驗(yàn)各做3個(gè)重復(fù)，PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序同上。

1.3.6實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用:以ERPV027基因克隆質(zhì)粒作為陽性對(duì)照，用熒光定量Taqman-PCR分別對(duì)取自鼠源性動(dòng)物糞便、組織等42份樣本的DNA樣品及鼠痘病毒感染樣本(鼠痘病毒感染的BHK21細(xì)胞)的DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1引物和探針的特異性

普通PCR和熒光定量Taqman-PCR分別對(duì)鼠痘病毒標(biāo)準(zhǔn)株ECT-BJ、ECT-GZ-1、ECT-GZ-2，分離株001、MB35、1436R、HZ進(jìn)行檢測(cè)，均能得到特異性擴(kuò)增條帶和曲線(圖1、2)。熒光定量Taqman-PCR對(duì)鼠痘病毒感染樣本，都能夠特異性擴(kuò)增，而對(duì)其它病毒及細(xì)菌，如牛痘病毒、泰澤病原體、仙臺(tái)病毒、小鼠肝炎病毒、沙門氏菌、李斯特桿菌、支氣管鮑特菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌則無擴(kuò)增結(jié)果。

注：M為100 bp DNA ladder；1-8依次為陰性對(duì)照(NTC)、ECT-GZ-2、ECT-BJ、001、MB35、1436R、HZ、ECT-GZ-1的擴(kuò)增結(jié)果圖1　各鼠痘病毒DNA樣本的普通PCR擴(kuò)增結(jié)果Note. Lane M represents 100 bp DNA ladder; Lanes 1-8 represent amplification results of NTC, ECT-GZ-2, ECT-BJ, 001, MB35, 1436R, HZ and ECT-GZ-1Fig.1　Regular PCR amplification results of each mouse poxvirus DNA samples

注：Delta Rn表示標(biāo)準(zhǔn)指示信號(hào)值減去基線信號(hào)值，Cycle Number表示PCR循環(huán)數(shù)。圖2　熒光定量Taqman-PCR檢測(cè)各鼠痘病毒DNA樣本的擴(kuò)增曲線Note. Delta Rn represents the standard indication signal minus the baseline signal value. Cycle number represents the number of PCR cycles.Fig.2　Amplification curve of mouse poxvirus DNA detected by FQ Taqman-PCR

2.2敏感性

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與表達(dá)式的建立:將ERPV_027基因克隆至PMD 18-T vector上，并對(duì)重組質(zhì)粒(21.7 ng/μL)依次作10倍稀釋直到21.7×10-8ng/μL。選取(21.7×10-8~21.7×10-1)ng/μL進(jìn)行TaqMan探針檢測(cè)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)是以10為底的質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)是循環(huán)閾值Ct。從標(biāo)準(zhǔn)曲線得出重組質(zhì)?？截悢?shù)(copy number)與循環(huán)閾值(Ct)之間的線性關(guān)系曲線表達(dá)式Ct = -3.47 × lg(copy number)+ 44.66，根據(jù)該表達(dá)式測(cè)算出重組質(zhì)粒的初始拷貝數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得知，已建立的熒光定量PCR的相關(guān)系數(shù)為R2= 0.996，擴(kuò)增效率為94%，表明已建立的熒光定量PCR方法誤差較小，使用的標(biāo)準(zhǔn)品是合格的(圖3、4)。

注：橫坐標(biāo)是以10為底的質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)是循環(huán)閾值Ct圖3　標(biāo)準(zhǔn)曲線Note. The abscissa is lg (Copy numbers), and ordinate is Ct.Fig.3　The standard curve

注：曲線從左到右依次為克隆質(zhì)粒21.7×10-1~21.7×10-7 ng/μL稀釋圖4　標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增圖Note. The curves from left to right are cloning plasmid 21.7×10-1~21.7×10-7 ng/μL dilutionFig.4　The standard amplification curves

2.2.2探針靈敏性檢測(cè):將ERPV027基因克隆質(zhì)粒(21.7 ng/μL)依次10倍稀釋直到21.7×10-9ng/μL，各取1 μL作為模板，用熒光定量Taqman-PCR進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：在40個(gè)PCR循環(huán)內(nèi)，最小可以檢測(cè)到21.7×10-8ng/μL，即：68 copies，探針靈敏性較好。擴(kuò)增曲線見圖5：從左到右分別是21.7×10-1ng/μL ~21.7×10-9ng/μL，21.7×10-9ng/μL已經(jīng)看不到完整的擴(kuò)增曲線。

2.3穩(wěn)定性和重復(fù)性

取鼠痘病毒標(biāo)準(zhǔn)株ECT-BJ、ECT-GZ-1、ECT-GZ-2，分離株001、MB35、1436R、HZ DNA及同一批熒光定量PCR檢測(cè)試劑于-20℃冰箱放置1周、2周、3周，用熒光定量Taqman-PCR檢測(cè)(表2)。3次試驗(yàn)各做3個(gè)重復(fù)，3次試驗(yàn)的Ct的標(biāo)準(zhǔn)差SD值小于0.5，變異系數(shù)(CV)小于5%，說明用引物027建立的FQ Taqman-PCR方法穩(wěn)定性和重復(fù)性均較好。

圖5　熒光定量Taqman-PCR對(duì)10倍梯度稀釋質(zhì)粒擴(kuò)增結(jié)果Fig.5　Amplification results of the plasmid in 10-fold dilutions by FQ Taqman-PCR

表2　鼠痘病毒DNA及試劑放置一段時(shí)間后用檢測(cè)結(jié)果

2.4實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用

以ERPV027基因克隆質(zhì)粒作為陽性對(duì)照，用熒光定量Taqman-PCR對(duì)取自鼠源性動(dòng)物糞便、組織等42份樣本的DNA樣品及鼠痘病毒感染樣本(鼠痘病毒感染的BHK21細(xì)胞)的DNA樣品進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)。鼠源性動(dòng)物糞便、組織中均未檢測(cè)出鼠痘病毒目的基因，鼠痘感染樣品中檢測(cè)到目的基因且含量較高。

3討論

目前國內(nèi)通用的檢測(cè)鼠痘病毒的方法是血清學(xué)方法，如免疫熒光技術(shù)(IFA)[3]、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)等。但對(duì)于急性發(fā)病鼠群，其體內(nèi)尚未產(chǎn)生相應(yīng)的抗體或抗體未達(dá)到可檢出的水平時(shí)，血清學(xué)方法會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，造成漏檢[9]。而且血清學(xué)檢測(cè)方法對(duì)抗原的純度要求較高，對(duì)能產(chǎn)生抗DNA抗體的小鼠血清會(huì)出現(xiàn)假陽性，且不能鑒別痘苗病毒免疫抗體和MPV感染所產(chǎn)生的抗體。對(duì)病毒的早期診斷，存在著很大的局限性。近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增病毒基因的特異DNA片段[10]，可以在病毒誘生抗體之前確定感染，且可分型和定量。目前，關(guān)于鼠痘病毒的普通PCR檢測(cè)已有相關(guān)報(bào)道[6-8]，但其熒光定量PCR檢測(cè)方法仍未見報(bào)道。

本研究從NCBI的FTP下載一株Ectromelia virus全基因組的基因序列(Ectromelia virus culture-collection ATCC:VR-1431，GenBank Accession No：JQ410350.1)，將其183個(gè)基因與Nt庫對(duì)比，獲得全部的比對(duì)結(jié)果。在分析比對(duì)結(jié)果時(shí)，發(fā)現(xiàn)ERPV_027，ERPV_60、 ERPV_64、 ERPV_77、 ERPV_116、 ERPV_140、 ERPV_142、 ERPV_145、 ERPV_148、 ERPV_149、 ERPV_150、 ERPV_174、 ERPV_175、 ERPV_177基因，有非常好的種內(nèi)特異和種間的差異性(與牛痘病毒差別較大)。我們選擇了特異性最好的三個(gè)基因ERPV_027、ERPV_150、ERPV_177三個(gè)基因作為候選基因，設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物。此外，我們還參考文獻(xiàn)，將鼠痘的secreted chemokine binding protein也作為靶基因設(shè)計(jì)引物。

針對(duì)ERPV_027、ERPV_150、ERPV_177三個(gè)基因，我們下載了不同分離株各三條序列，針對(duì)secreted chemokine binding protein我們下載了五條分離株的序列，利用Mega5進(jìn)行多序列聯(lián)配，針對(duì)不同分離株的保守性區(qū)域利用Primer Express 3.0設(shè)計(jì)引物和探針(表1)。我們將4對(duì)引物用普通PCR對(duì)標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)都能得到目的條帶，之后又對(duì)不同來源的分離株進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)僅ERPV_027有很好的擴(kuò)增效果。我們將ERPV_027基因作為候選基因，對(duì)7株病毒株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果也符合預(yù)期。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證其特異性，我們對(duì)32個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)，其中18個(gè)樣本為鼠痘感染的生物樣本，其余樣本為不同病原體感染的生物樣本。檢測(cè)結(jié)果顯示我們所設(shè)計(jì)的探針的特異性為100%。為了檢測(cè)引物的靈敏性，我們制作了該目的基因的標(biāo)準(zhǔn)品，Taqman檢測(cè)結(jié)果表明該方法對(duì)鼠痘病毒的檢測(cè)限為68 copies/μL，與普通PCR相比，大大提高了檢測(cè)靈敏度。取鼠痘病毒標(biāo)準(zhǔn)株和分離株樣品DNA及同一批PCR檢測(cè)試劑于-20℃冰箱放置1周、2周、3周，Taqman PCR檢測(cè)能得到良好的擴(kuò)增效果，證明所建立的方法穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。用熒光定量Taqman-PCR均未從鼠源性動(dòng)物糞便、組織樣本的DNA中檢出鼠痘病毒目的基因，但從鼠痘感染樣本的DNA中檢測(cè)到目的基因且含量較高，證明該方法具有良好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

本方法在實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用中，僅對(duì)本實(shí)驗(yàn)室收集的沙鼠糞便和組織，野鼠糞便樣本及鼠痘病毒感染的BHK21細(xì)胞樣本進(jìn)行了檢測(cè)，并未對(duì)鼠痘感染的動(dòng)物組織樣本進(jìn)行過檢測(cè)，表明該方法在實(shí)際應(yīng)用中，尚需進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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〔修回日期〕2015-05-18

技術(shù)方法

Establishment and application of a fluorescence quantitative

Taqman-PCR detection method of mouse poxvirus

Du Jiang-tao1, DAI Fang-wei1, ZHOU Sha-sang1, SONG Xiao-ming2, LV Yu1, SA Xiao-ying1

(1. Center of Laboratory Animals, Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013, China;

2. Center of Laboratory Animals, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036)

【Abstract】ObjectiveTo establish a fluorescence quantitative Taqman-PCR method for rapid and accurate detection of mouse poxvirus. Methods After sequence alignment and comparison, ERPV027 gene was selected as the primer and probe design gene. Furthermore, the specificity, sensitivity, stability and reproducibility of these primers and probes were detected. ResultsThe detection limitation of this method was 68 copies/μL. Data showed that this method has high specificity, which specifically amplifies mouse poxvirus, with no amplification signal of mouse hepatitis virus, Sendai virus, Salmonella and some other viruses and bacteria. This method also showed good stability and reproducibility. ConclusionsThis study has successfully established a fluorescence quantitative Taqman-PCR method for detection of mouse poxvirus, with high specificity, sensitivity, good stability and reproducibility, and a broad application potential.

【Key words】Mouse poxvirus; Fluorescence quantitative PCR; Taqman probe

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.006.012

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2015) 06-0059-06

[通訊作者]薩曉嬰。E-mail: saxiaoyin@163.com。

[作者簡(jiǎn)介]杜江濤(1986-)男，研究實(shí)習(xí)員，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測(cè)等工作。E-mail: djtao1986@126.com。

[基金項(xiàng)目]科技部“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目子項(xiàng)目(2013BAK11B01-41)，浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012ZDA010)，浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012C37097)。