秦力維，張寧坤，路　平，彭秀軍，王桂琴，高　原，曹利群，崔　蓓， 郭建巍

(海軍總醫(yī)院1眼科，2心臟中心，3病理科，4檢驗(yàn)科，北京　100048 )

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靶向臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建及其在小鼠脾臟內(nèi)的定位

秦力維1，張寧坤2，路平3，彭秀軍1，王桂琴1，高原1，曹利群1，崔蓓1， 郭建巍4

(海軍總醫(yī)院1眼科，2心臟中心，3病理科，4檢驗(yàn)科，北京100048 )

【摘要】目的構(gòu)建含小分子肽P1-GFP融合基因慢病毒載體，用攜帶P1-GFP融合基因的慢病毒感染MSC，使MSC具有靶向性，將靶向MSC注入小鼠體內(nèi)后觀察MSC在小鼠脾臟的定位及與淋巴細(xì)胞的關(guān)系。方法用組織片貼壁法培養(yǎng)健康人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，用基因工程技術(shù)構(gòu)建含小分子肽P1-GFP融合基因慢病毒載體并感染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，通過尾靜脈將轉(zhuǎn)入P1-GFP融合基因的MSC注入小鼠體內(nèi)，18 h后免疫組化染色觀察GFP在小鼠脾臟的定位。 結(jié)果 培養(yǎng)的健康人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長良好，MSC感染含P1-GFP融合基因的慢病毒18 h后MSC開始出現(xiàn)綠色熒光，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，72 h達(dá)高峰。靶向MSC表達(dá)髓系干細(xì)胞的表面標(biāo)記 CD105(90.0%)/CD44(98%),CD73(85.0%)/ CD90(98.5%)。將靶向MSC經(jīng)尾靜脈注入小鼠體內(nèi)， 18 h后小鼠脾臟出現(xiàn)大量GFP陽性細(xì)胞，并與脾臟淋巴細(xì)胞密切接觸。結(jié)論本研究成功構(gòu)建了含P1-GFP融合基因的靶向MSC，靶向MSC成功定向脾臟，并與脾臟淋巴細(xì)胞密切接觸，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

【關(guān)鍵詞】靶向；臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；慢病毒；脾臟

Construction of targeted umbilical cord derived mesenchymal

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)是來源于胚胎中胚層的一類成體干細(xì)胞，除具有向多胚層細(xì)胞分化、促進(jìn)損傷修復(fù)、抗炎以及神經(jīng)營養(yǎng)等功能外[1]，MSC還可減低以樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DC)DC為代表的單核巨噬細(xì)胞抗原遞呈能力，具有免疫抑制作用[2]。我們在前期研究中獲得了一種能與單核巨噬細(xì)胞特異性結(jié)合的小分子肽P1，在P1肽的導(dǎo)向下，P1-綠色熒光蛋白(GFP)融合蛋白在粘膜免疫中可到達(dá)消化道免疫相關(guān)組織[3]。 本研究的目的旨在構(gòu)建P1-GFP融合基因慢病毒載體，用攜帶P1-GFP融合基因的慢病毒感染MSC，使MSC具有靶向性，希望通過小分子肽P1把 MSC 帶到DC等抗原呈遞細(xì)胞處，以期在后續(xù)的研究中提高M(jìn)SC在自身免疫性疾病中的治療效率。

1材料和方法

1.1試劑

BamHI / AgeI限制性核酸內(nèi)切酶(NEB)， 瓊脂糖(賽百盛公司)， In-FusionTMPCR Cloning Kit(Clontech)，Taq polymerase(SinoBio)， dNTP(Takara)， Plasmid 抽提 Kit(Promega)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化)，Primer由瑞生物技術(shù)有限公司合成，兔抗GFP多克隆抗體(北京康為世紀(jì)有限公司)；引物 KL6470-P1： GATCCCGCCACCA TGAGCAGTGAAAAGGCTGAACAACAGTGGGCTA，K L6470-P2：CCGGTAGCCCACTGTTGTTCAGCCTTTTC ACTGCTCATGGTGGCGG。PCR鑒定引物KL6470-P3：GTGAAAAGGCTGAACAACAGTG，EGFP-N-R：CG TCGCCGTCCAGCTCGACCAG

1.2儀器

PCR儀(ABI 7600),穩(wěn)壓DNA電泳儀(Bio-Rad),凝膠成像儀(天能公司), HI-9211K細(xì)菌搖床(華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司),細(xì)菌培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司), TGL-16G-A高速離心機(jī)(日立公司)。

1.3載體信息

載體名稱：GV287(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供)，元件順序：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-P1-EGFP；Ubi-MCS-3FLAG-SV40- EGFP(圖1)。

1.4動物

雌性C57小鼠，SPF 級，體重18～20 g, 購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK (軍)2012-0004，由海軍總醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，使用許可證號：SYXK (軍)2012-0012。

圖1　GV287載體構(gòu)建示意圖Fig.1　Schematic diagram of the construction of vector GV287

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的高效分離與鑒定[4]：無菌取剖腹產(chǎn)新鮮臍帶， 以平衡鹽溶液洗去臍帶殘留血液， 剪成 3～4 cm 的小段，取每一段沿靜脈腔剪開，平鋪后剔除臍帶動、靜脈，取血管之間血管與外膜之間的膠狀物并剪切成小于 1 mm3小塊，以平衡鹽溶液沖洗后， 把組織塊放置含15% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基， 在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后半量換液，待組織塊周圍均有貼壁細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)， 移出組織塊，當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增占 80%～90% 細(xì)胞瓶底面積時(shí)，用0.05% 胰蛋白酶-EDTA液消化后傳代，用0.01 mol/L PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL， 0.01 mol/L PBS 洗滌2 次后， 加入 PBS 1 mL重懸細(xì)胞，取1×106個(gè)細(xì)胞待用，本研究用第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5.2過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建：委托上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成，實(shí)驗(yàn)組含P1-GFP融合基因，對照組只含GFP基因。 病毒效價(jià)TU/μL=2.00E + 8 TU/mL。

1.5.3用慢病毒載體感染MSC：用含15% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MSC，感染前保證MSC良好生長狀態(tài)，進(jìn)行病毒感染時(shí)細(xì)胞的融合率約為 30%～50%，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。預(yù)先從-80℃取出病毒液在冰上融化，同時(shí)在培養(yǎng)基中添加 5 μg/mL 的polybrene，輕輕混勻，使培養(yǎng)基和病毒等試劑充分混勻，然后把細(xì)胞板放回培養(yǎng)箱孵育。 8～12 h以后觀察細(xì)胞狀態(tài)，棄去細(xì)胞上清液，更換為新鮮含15% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。 感染后每日觀察熒光表達(dá)情況，72 h后收獲細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.4MSC經(jīng)靜脈輸入小鼠體內(nèi)后的分布：用無菌PBS調(diào)整慢病毒載體感染臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞濃度至1×106/ mL，隨機(jī)數(shù)字法將10只雌性BALB/C小鼠分為實(shí)驗(yàn)組及對照組二組，每組5只。實(shí)驗(yàn)組和對照組每只小鼠尾靜脈注射分別注入含P1-GFP 和GFP融合基因的MSCs細(xì)胞液，每只0.5 mL，分別于6 h、12 h、18 h后處死，取脾臟30%甲醛固定24 h，常規(guī)免疫組化染色，顯微鏡下觀察GFP在脾臟的分布及與淋巴細(xì)胞的關(guān)系。

2結(jié)果

2.1 MSC形態(tài)及病毒感染效果

培養(yǎng)的MSC細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則長梭形， 邊緣較鈍，細(xì)胞內(nèi)外不見明顯顆粒， 表面光滑、狀態(tài)良好，(圖2A)。慢病毒感染的含目的基因MSC形態(tài)細(xì)胞形態(tài)仍呈不規(guī)則長梭形， 邊緣光滑，細(xì)胞內(nèi)外偶見顆粒，狀態(tài)良好(圖2B)。用熒光顯微鏡每日觀察慢病毒感染含目的基因MSC，發(fā)現(xiàn)感染18 h后MSC開始出現(xiàn)綠色熒光，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)(圖3A)，到72 h達(dá)高峰(圖3B)，以后逐漸下降，本研究選用感染后72 h的細(xì)胞用于動物實(shí)驗(yàn)。(圖2，3見文后彩插3)。

慢病毒感染的含目的基因的MSC仍表達(dá)髓系間質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記 CD105(90.0%)/CD44(98%), CD73(85.0%)/ CD90(98.5%)(圖4)。

2.1 MSC經(jīng)靜脈輸入小鼠體內(nèi)后的分布

將慢病毒載體感染臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)靜脈途徑輸入小鼠體內(nèi)， 不同時(shí)間段取小鼠脾臟，經(jīng)免疫組化染色，在18 h取出的小鼠脾臟發(fā)現(xiàn)了大量GFP陽性細(xì)胞(圖5C)，空載體與GFP對照組陽性信號明顯低于實(shí)驗(yàn)組(圖5A,圖5B)，說明靶向MSC成功定向脾臟，并與脾臟淋巴細(xì)胞密切接觸。(圖4，5見文后彩插4)。

3討論

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord derived mesenchymal stem cells，UC-MSCs)是組織工程和再生醫(yī)學(xué)理想的種子細(xì)胞[1、2、4]。目前，用MSC治療疾病的臨床試驗(yàn)正在許多國家進(jìn)行，但干細(xì)胞療法的成功與否很大程度依賴足量的干細(xì)胞歸巢到損傷組織，提高M(jìn)SC歸巢至靶器官是治療疾病的關(guān)鍵。

巨噬細(xì)胞在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、腎炎、甲狀腺炎、變應(yīng)性腦脊髓炎等實(shí)驗(yàn)性自身免疫性疾病的組織損傷中發(fā)揮著重要作用。骨髓來源的活化的巨噬細(xì)胞是實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis, EAU)[5]組織損傷中主要的效應(yīng)細(xì)胞。而巨噬細(xì)胞并未行使抗原呈遞的功能，而是在組織損傷中發(fā)揮了效應(yīng)細(xì)胞和清除死亡細(xì)胞的功能。目前所有研究結(jié)果均提示抑制樹突狀細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞功能，改變免疫應(yīng)答類型將是治療EAU的一個(gè)有效途徑，并在最新的研究中得到了證明[6]。

在國家自然科學(xué)基金的資助下，本課題組獲得了一種具有自主知識產(chǎn)權(quán)的、能與單核巨噬細(xì)胞特異性結(jié)合的小分子肽P1，在P1肽的導(dǎo)向下，P1-綠色熒光蛋白(GFP)融合蛋白在粘膜免疫中可到達(dá)消化道免疫相關(guān)組織。P1-GFP融合蛋白免疫小鼠后，小鼠脾臟中的CD4+細(xì)胞通過分泌TGFβ和非成熟DC共同發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)作用[3、7、8]。

本研究通過分子克隆技術(shù)，將前期研究獲得的能特異性靶向抗原呈遞細(xì)胞的小分子肽P1與GFP融合蛋白成功克隆入慢病毒病毒載體，通過慢病毒感染使MSC獲得融合蛋白基因[9]， 制備了靶向MSC。將慢病毒載體感染臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)靜脈途徑注入小鼠體內(nèi)， 18 h后在小鼠脾臟發(fā)現(xiàn)了大量GFP陽性細(xì)胞，說明靶向MSC成功定向脾臟，并與脾臟淋巴細(xì)胞密切接觸。

脾臟是體內(nèi)重要的外周淋巴器官，是免疫應(yīng)答發(fā)生的主要場所，脾臟主要通過單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)揮吞噬作用而實(shí)現(xiàn)在非特異性免疫調(diào)控，在抗感染免疫和腫瘤免疫中具有重要的作用。 我構(gòu)建的靶向MSC成功定向脾臟，并與脾臟淋巴細(xì)胞密切接觸，說明我們構(gòu)建的靶向MSC功能良好，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

由于MSC在體外還可減低DC抗原遞呈能力，抑制T細(xì)胞增殖，抑制Th1和Th17細(xì)胞因子分泌，增強(qiáng)Th2細(xì)胞因子分泌，上調(diào)CD4+CD25+Treg細(xì)胞[10-13]，通過靶向MSC改善脾臟中DC和巨噬細(xì)胞免疫微環(huán)境，重建免疫平衡，抑制EAU的進(jìn)展將是我們下一步要做到的工作。

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〔修回日期〕2015-04-25

研究報(bào)告

stem cells and their distribution in the mouse spleen

QIN Li-wei1，ZHAMG Ning-kun2，LU Ping3，PENG Xiu-jun1，WANG Gui-qin1，

GAO Yuan1，CAO Li-qun1，CUI Bei1， GUO Jian-wei4

(1. Department of Ophthalmology ,2. Heart Center, 3. Department of Pathology,

4. Department of Clinical Laboratory, Chinese PLA Navy General Hospital, Beijing 100048, China )

【Abstract】ObjectiveTo construct lentiviral vectors containing peptide P1-GFP fusion genes. Umbilical cord derived mesenchymal stem cells were infected with lentivirus carrying peptide P1 and GFP fusion genes. To inject the targeted umbilical cord derived mesenchymal stem cells into mice and to detect GFP expression in the spleen. MethodsUmbilical cord derived mesenchymal stem cells were cultured with adhered tissues of umbilical cord smaller than 1 mm3. Lentiviral vector containing P1-GFP fusion genes with engineering technology was constructed and infected the umbilical cord derive mesenchymal stem cells. Targeted umbilical cord derived mesenchymal stem cells were intravenously injected in the mouse tail vein and after 18 hours GFP expression was detected with immunohistochamical staining of the spleen tissues. ResultsHarvested umbilical cord derived mesenchymal stem cells grew well in culture medium. Green fluorescence on umbilical cord derived mesenchymal stem cells were observed under fluorescence microscope at 18 hours after infected with lentivirus. Green fluorescence intensity of umbilical cord derived mesenchymal stem cells was increasing over time and reached a peak at 72 hours. Umbilical cord derived mesenchymal stem cells highly expressed CD105 (90.0%)/CD44 (98%) and CD73 (85.0%)/ CD90 (98.5%) molecules. GFP expression was detected in the spleen after intravenous injection of targeted umbilical cord derived mesenchymal stem cells in the mice 18 hours later. GFP expressing cells intimately contacted with lymphocytes. ConclusionsTargeted umbilical cord derived mesenchymal stem cells contain P1-GFP fusion genes are constructed. Targeted umbilical cord derived mesenchymal stem cells can be targeted to mouse spleen and intimately contact with lymphocytes after intravenous injection. Our results lay the groundwork for further studies.

【Key words】Targeted umbilical cord derived mesenchymal stem cells; Lentivirus; Spleen; Mice

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.006.007

【中圖分類號】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 06-0032-04

[通訊作者]郭建巍，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，從事分子診斷臨床及研究工作。E mail: jwkuo@sohu.com。

[作者簡介]秦力維，女，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事視網(wǎng)膜疾病的免疫治療。E mail: lwkin@sohu.com。

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金(30872394)及海軍總醫(yī)院創(chuàng)新培育基金資助(CXPY201312)。