柯　志，周冬梅，徐　軍，孫文正，楊　彬

(廣東東陽光藥業(yè)有限公司，廣東　東莞　523867)

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毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢測(cè)抗EGFR抗體的電荷異質(zhì)性

柯志，周冬梅，徐軍，孫文正，楊彬*

(廣東東陽光藥業(yè)有限公司，廣東東莞523867)

單克隆抗體憑借其高特異性和低副作用的優(yōu)點(diǎn)成為生物藥研究的熱點(diǎn)[1]?？贵w在生產(chǎn)和儲(chǔ)存過程中，自身的翻譯后修飾和儲(chǔ)存條件會(huì)影響其電荷異質(zhì)性[2]，如琥珀酰亞胺修飾[3]、C末端賴氨酸修飾、酰胺化、氧化會(huì)產(chǎn)生堿性變體[4]，脫酰胺、唾液酸化、焦谷氨酸環(huán)化[5]會(huì)產(chǎn)生酸性變體。除此之外，片段化會(huì)雙向產(chǎn)生酸堿變體，異天冬氨酸化會(huì)影響表面電荷分布[6]。這些變體不僅可能影響抗體的生物活性，還可能影響抗體的穩(wěn)定性。同時(shí)，電荷異質(zhì)性作為生物藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，是進(jìn)行克隆篩選[7]、衡量生產(chǎn)工藝、工廠生產(chǎn)批次放行和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的重要指標(biāo)。因此，需要建立一種快速且穩(wěn)定的方法對(duì)其進(jìn)行分析。

單抗電荷異質(zhì)性最常用的檢測(cè)方法有等電聚焦(IEF)、離子交換色譜[8](IEC)、毛細(xì)管等電聚焦電泳[9](CIEF)、成像毛細(xì)管電泳(iCE)[10]及毛細(xì)管區(qū)帶電泳[11](CZE)等。IEF是檢測(cè)單抗電荷異質(zhì)性的傳統(tǒng)方法，該方法分辨率高，但耗時(shí)長(zhǎng)且變異性高。目前較多用于單抗電荷異質(zhì)性的檢測(cè)方法為IEC和毛細(xì)管電泳法(CE，包括CIEF、iCE、CZE)。CE法因柱效高、進(jìn)樣量少、分離度好而成為單抗分析的常規(guī)手段[12]。CIEF分辨率高同時(shí)能精確測(cè)定PI值，但其兩步分離耗時(shí)長(zhǎng)[13]；具有相似分離原理的iCE只需一步聚焦，能顯著減少分析時(shí)間，但與CIEF一樣，其涂層毛細(xì)管使用壽命短，且所用兩性電解質(zhì)以及分離液成本高，從而限制了這兩種方法的使用。

CZE是毛細(xì)管電泳中最基本、應(yīng)用最廣泛的分離模式。2011年，He等[14]建立了一種新的CZE方法用于檢測(cè)抗體電荷異質(zhì)性。隨后Shi等[15]采用醋酸鹽作為分離液，聚環(huán)氧乙烯(PEO)和三亞乙基四胺(TETA)為添加劑，建立了另一種檢測(cè)電荷異質(zhì)性的方法。曹俊姿等[16]利用裸管，采用尿素為添加劑建立了相似的方法來檢測(cè)單抗電荷異質(zhì)性。隨后,郭瑋等[17]利用涂層毛細(xì)管，不使用添加劑建立了另一種分離方法。在CZE方法分離單抗的過程中，由于單抗吸附會(huì)使柱效降低，產(chǎn)生電滲流，使得重現(xiàn)性和分離度變差。因此一般選用中性毛細(xì)管，同時(shí)加入添加劑以抑制吸附和電滲流。

本文采用CZE方法，以未涂層毛細(xì)管進(jìn)行檢測(cè)，降低了成本，通過優(yōu)化分離液的pH值、分離電壓、分離溫度以及添加劑的濃度，建立了快速、準(zhǔn)確、特異的單抗產(chǎn)品毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢測(cè)方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

6-氨基己酸(EACA，99%)、三亞乙基四胺(TETA，97%)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、甲基纖維素(MC)、尿素(Urea，99%)、冰乙酸(99.7%)均購于美國Sigma Aldrich公司；0.1 mol·L-1鹽酸(美國Beckman Coulter公司)；所有抗EGFR單抗原液均來自東陽光藥業(yè)研究院；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

PA800 Plus型毛細(xì)管電泳儀(美國Beckman Coulter公司)；熔融石英毛細(xì)管(有效長(zhǎng)度20 cm，內(nèi)徑50 μm，美國Beckman Coulter公司)；SevenExcellence型pH計(jì)(美國Mettler Toledo公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)條件及方法

新的毛細(xì)管使用前，依次用甲醇(20 psi，5 min)、0.1 mol·L-1HCl(20 psi，15 min)、超純水(20 psi，5 min)沖洗活化。采用UV檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，樣品盤溫度10 ℃，毛細(xì)管溫度20 ℃。分離緩沖液為380 mmol·L-1EACA、1.9 mmol·L-1TETA、0.1% HPMC的混合緩沖液(pH 6.0)。每次實(shí)驗(yàn)前用0.1 mol·L-1HCl沖洗3 min(50 psi)后，用水沖洗2 min(50 psi)，再用分離緩沖液沖洗5 min(50 psi)。壓力進(jìn)樣10 s(0.5 psi)，分離電壓為25 kV，分離時(shí)間8 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用0.1 mol·L-1HCl沖洗毛細(xì)管5 min(50 psi)，毛細(xì)管兩端置于超純水中保存。

1.3樣品及溶液制備

樣品制備：將抗EGFR抗體溶液用超純水稀釋至1 mg·mL-1，取90 μL于進(jìn)樣小管中進(jìn)樣。

分離液儲(chǔ)存液為400 mmol·L-1EACA， 2 mmol·L-1TETA，用冰乙酸調(diào)至pH 6.0。

分離緩沖液：取分離液儲(chǔ)存液8.10 mL，加入900 μL 1%HPMC。渦旋混勻，臨用新配。

2結(jié)果與討論

2.1分離檢測(cè)條件的優(yōu)化

圖1　EACA濃度對(duì)分離度(A)與遷移時(shí)間(B)的影響Fig.1　Effect of EACA concentration on resolution(A) and migration time(B)

2.1.1分離緩沖液濃度的影響區(qū)帶電泳要求分離緩沖液提供穩(wěn)定的背景信號(hào)和較低的電流。分離緩沖液濃度高，緩沖容量大，可以抑制毛細(xì)管內(nèi)壁對(duì)蛋白的吸附，但同時(shí)緩沖液的離子強(qiáng)度增大，其相應(yīng)的電流也增大，一方面會(huì)造成基線不穩(wěn)，重復(fù)性差，產(chǎn)生的焦耳熱降低柱效、影響柱的使用壽命；另一方面，離子強(qiáng)度增大還會(huì)壓縮雙電層，抑制電滲流，延長(zhǎng)遷移時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)考察了EACA濃度分別為300，350，380，450，500 mmol·L-1時(shí)對(duì)主峰與堿變體2之間分離度及主峰遷移時(shí)間的影響(見圖1)。結(jié)果表明，緩沖液濃度為380 mmol·L-1時(shí)，主峰與堿變體2之間的分離度達(dá)到最大值，遷移時(shí)間隨著緩沖液濃度的增加而增大，但相隔不超過1 min，所以最終選擇EACA的濃度為380 mmol·L-1。

2.1.2分離緩沖液pH值的影響毛細(xì)管電泳中，分離緩沖液的pH值越小，電滲流越小；另一方面緩沖液pH值在小于抗體pI的前提下，pH值越小，抗體所帶的正電荷則會(huì)越多，在正電壓分離模式下，遷移時(shí)間顯著減小，但分離度會(huì)降低。所以優(yōu)化pH值要同時(shí)考慮分離度和分離時(shí)間。在此基礎(chǔ)上，對(duì)不同分離緩沖液pH值( 4.0，5.0，5.4，5.7，6.0，6.2，7.0)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明：分離緩沖液pH值在4.0～6.0時(shí)主峰與堿變體2的分離度逐漸增大，超過pH 6.2則分離度逐漸減??；遷移時(shí)間在pH 4.0時(shí)最快，超過pH 5.0變化不大。因此本文選擇pH 6.0作為分離緩沖液的最佳pH值。

圖2　pH值對(duì)分離度(A)與遷移時(shí)間(B)的影響Fig.2　Effect of pH value on resolution(A) and migration time(B)

2.1.3添加劑的影響區(qū)帶電泳中，通常會(huì)在分離緩沖液中加入添加劑以抑制管壁對(duì)蛋白的吸附，提高分離度。一般選擇表面活性劑或者中性高分子[18]。本實(shí)驗(yàn)通過加入線性高分子HPMC在毛細(xì)管內(nèi)壁形成動(dòng)態(tài)保護(hù)層，減少蛋白吸附，但過多的HPMC會(huì)使緩沖液粘度增加，分離時(shí)間延長(zhǎng)，譜帶展寬效應(yīng)增加，分離度變低，同時(shí)引起進(jìn)樣量減少；加入的多胺TETA會(huì)競(jìng)爭(zhēng)蛋白與毛細(xì)管內(nèi)壁Si—OH基團(tuán)結(jié)合，也可以抑制蛋白吸附，但過量的TETA會(huì)與單抗的羧基反應(yīng)改變單抗電荷異質(zhì)性。因此，本文對(duì)HPMC濃度(0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%)和TETA濃度(1.5，1.9，3.5，4.0 mmol·L-1)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，HPMC濃度為0.1%時(shí)主峰與堿變體2的分離度最好，超過0.15%時(shí)則分離度顯著變??；TETA濃度為1.9 mmol·L-1時(shí)主峰與堿變體2的分離度最高，超過1.9 mmol·L-1則逐漸降低。所以選擇HPMC和TETA的濃度分別為0.1%和1.9 mmol·L-1。

圖3　抗EGFR抗體的電泳圖譜Fig.3　Electrophoretogram of anti-EGFR antibody1.basic variants 1 (堿變體1)；2.basic variants 2 (堿變體2)；3.main component(主成分)；4. acidic variants ( 酸變體)

2.1.4電壓與柱溫的影響在一定范圍內(nèi)提高電壓可以減少遷移時(shí)間，減小峰寬。但場(chǎng)強(qiáng)的增大會(huì)產(chǎn)生更大的焦耳熱，使柱效降低，同時(shí)影響重復(fù)性。柱溫升高可以增加毛細(xì)管壁Si—OH基團(tuán)的解離，增加電滲流，提高分離效率，但高柱溫產(chǎn)生的高焦耳熱使柱效降低，影響分離度。本文分別考察了不同電壓(20，25，30 kV)和柱溫(15，20，25，30 ℃)下主峰與堿變體2的分離度，結(jié)果表明,電壓25 kV，柱溫20 ℃時(shí)，主峰與堿變體2的分離度最高。

確定優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件為：分離電壓25 kV，柱溫20 ℃，EACA，HPMC和TETA的濃度分別為380 mmol·L-1，0.1%和1.9 mmol·L-1，緩沖液pH 6.0。在該條件下分離抗EGFR抗體參比制劑的基線良好，主峰與堿變體2的分離度最高(圖3)。

表1　線性和定量下限結(jié)果

2.2方法學(xué)考察

2.2.1線性與定量下限取抗EGFR抗體溶液，用超純水稀釋，配成1.0，0.75，0.5，0.25，0.1 mg·mL-1的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行線性考察，以濃度(x,mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性擬合，結(jié)果見表1。主成分及酸、堿變體的線性范圍為0.1～1 mg·mL-1,相關(guān)系數(shù)均大于0.99。將抗EGFR抗體溶液繼續(xù)稀釋，以信噪比(S/N)為10時(shí)的抗體溶液濃度為定量下限，主成分、酸、堿變體1和堿變體2的定量下限(LOQ)分別為30.0，150.2，125.2，93.3 μg·L-1。

2.2.2重復(fù)性按“1.3”方法平行制備6份抗EGFR抗體溶液樣品進(jìn)行分析，考察6份樣品的主峰、酸堿變體的遷移時(shí)間和相對(duì)百分含量(用面積歸一化法計(jì)算)的平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表2。6份樣品的主峰、酸堿變體的遷移時(shí)間和相對(duì)百分含量的RSD均小于2%，重復(fù)性良好，可以滿足電荷異質(zhì)性的分析要求。

表2　重復(fù)性結(jié)果(n=6)

2.2.3中間精密度由另一分析人員按“1.3”方法平行制備6份抗EGFR抗體溶液樣品進(jìn)行分析，連同重復(fù)性考察的6份樣品，分析此12份樣品的主峰、酸堿變體的遷移時(shí)間和相對(duì)百分含量的平均值和RSD值，結(jié)果見表3。12份樣品的主峰、酸堿變體的遷移時(shí)間和相對(duì)百分含量的RSD均小于2%，可見方法的中間精密度良好。

表3　中間精密度結(jié)果(n=12)

2.2.4準(zhǔn)確度將EGFR抗體溶液稀釋至1.0，0.75，0.5，0.25，0.1 mg·mL-1系列濃度，此濃度記為C0，每一濃度樣品平行制備3份。進(jìn)樣分析得到各組分的峰面積對(duì)濃度的線性回歸方程。將C0濃度下3份樣品的峰面積平均值代入線性方程計(jì)算得到濃度Ce，則回收率R(recovery)%=Ce/C0×100%。各濃度的回收率見表4。結(jié)果顯示各組分的回收率為95.4%～105.4%。

表4　不同濃度各組分的回收率

2.3樣品測(cè)定及方法比較

按“1.3”方法平行制備3份抗EGFR抗體溶液樣品，分別用本方法和文獻(xiàn)方法[16]進(jìn)行分析，結(jié)果如表5所示。結(jié)果顯示，兩種方法下，主峰的相對(duì)百分含量基本一致，RSD值小于1%；但文獻(xiàn)所需的遷移時(shí)間長(zhǎng)達(dá)19.433 min，而本文的出峰時(shí)間僅為4.846 min?？梢姳痉椒ǜ焖?，可以極大地提高檢測(cè)效率。

表5　兩種方法的比較

3結(jié)論

本文采用CZE模式，以EACA作為分離緩沖液，HPMC和TETA作為添加劑，建立了抗EGFR抗體電荷異質(zhì)性的檢測(cè)方法。該方法精密度和準(zhǔn)確度良好，且不需要樣品前處理、實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、快速、成本低，是一種理想的抗體電荷異質(zhì)性檢測(cè)方法。

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摘要：建立了抗表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抗體電荷異質(zhì)性的檢測(cè)方法。采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)模式，考察了分離緩沖液濃度和pH值、添加劑、分離電壓、毛細(xì)管溫度對(duì)主峰與酸堿性變體分離度的影響。以380 mmol·L-16-氨基己酸(EACA，pH 6.0)為分離緩沖液，0.1%羥丙基甲基纖維素(HPMC)和1.9 mmol·L-1三亞乙基四胺(TETA)作為添加劑，分離電壓25 kV，分離時(shí)間8 min，毛細(xì)管溫度20 ℃條件下，電荷變體能夠得到良好分離，且在0.1～1 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，主成分、酸、堿變體1和堿變體2的定量下限(LOQ)分別為30.0，150.2，125.2，93.3 μg·L-1，重復(fù)性和中間精密度RSD值小于2%，回收率為95.4%～105.4%。該方法簡(jiǎn)單、快速、成本低，可以滿足抗EGFR抗體的電荷異質(zhì)性檢測(cè)要求。

關(guān)鍵詞：毛細(xì)管區(qū)帶電泳；電荷異質(zhì)性；抗EGFR抗體；添加劑

Charge Variants Determination of Anti-EGFR Antibody by Capillary Zone ElectrophoresisKE Zhi，ZHOU Dong-mei，XU Jun，SUEN Wen-chen，YANG Bin*

(Sunshine Lake Pharma Co.,Ltd.，Dongguan523867，China)

Abstract：A simple and rapid capillary zone electrophoresis method was developed for charge variants determination of anti-epidermal growth factor receptor(EGFR) antibody.To obtain better resolution of antibody charge variants and less analysis time，a number of separation parameters were investigated，including concentration and pH value of separation buffer，concentration of additives，separation voltage and temperature of capillary.The optimized conditions were as follows: separation buffer:pH 6.0 380 mmol·L-16-aminocaproic acid(EACA) containing 0.1% hydroxypropyl methyl cellulose(HPMC) and 1.9 mmol·L-1triethylenetetramine(TETA)；applied separation voltage:25 kV；capillary temperature: 20 ℃.Under the optimized conditions，the highest resolution was obtained among all the charge variants in 8 min.Meanwhile，all the components，including the main component，acidic variants，basic variants 1 and basic variants 2，were linear in the range of 0.1-1 mg·mL-1with correlation coefficients more than 0.99.The limit of quantitation for the four charge variants were 30.0，150.2，125.2 ,93.3 μg·L-1，respectively.The method showed a good repeatability and intermediate precision for all components with RSDs less than 2%，and the recoveries for all the antibody charge variants ranged from 95.4% to 105.4%.This method was simple，rapid and low cost，and could meet the requirement for the determination the charge variants of anti-EGFR antibody.

Key words：capillary zone electrophoresis；charge variants；anti-EGFR antibody；additives

中圖分類號(hào)：O657.8;S852.43

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào)：1004-4957(2015)12-1414-05

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2015.12.015

通訊作者：*楊彬，碩士，研究方向：?jiǎn)慰寺】贵w藥物，Tel：0769-39005888-5717，E-mail：YangBin@hecpharm.com

基金項(xiàng)目：廣東省引進(jìn)創(chuàng)新科研團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目(201101Y0104990178)

收稿日期：2015-05-12；修回日期：2015-05-26