劉 凡　朱天生,2　訾莉莉　劉振亞　李龍　劉 濤　熊仁次,2*

(1 塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院， 新疆 阿拉爾843300)(2 南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室， 新疆 阿拉爾843300)

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南疆駿棗著色期果面異常褐變分離菌鑒定

劉 凡1朱天生1,2訾莉莉1劉振亞1李龍1劉 濤1熊仁次1,2*

(1 塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院， 新疆 阿拉爾843300)(2 南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室， 新疆 阿拉爾843300)

摘要2013年新疆南疆地區(qū)在駿棗著色期果實表面大量發(fā)生異常褐變，后期黑斑病發(fā)病率高，為探索褐變原因，對病果采樣分離獲得菌株LF。菌株LF經(jīng)柯赫氏法則驗證可引起類似癥狀，依據(jù)菌株LF形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定；分離菌株提取DNA后分別PCR擴(kuò)增ITS、EF-1α、β-tubulin和ATPase四個基因片段，分別對擴(kuò)增的4個基因片段測序后登錄Genebank進(jìn)行Blast序列比對和分析，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)合分子生物學(xué)鑒定，確定菌株LF為鏈格孢屬鏈格孢Alternaria alternata(Fr.：Fr.)Keissler。

關(guān)鍵詞駿棗； 病害； 鑒定

紅棗(Zizyphusju jubadaetes)為鼠李科( Rhamnaceae)棗屬植物,棗樹(Zizyphus jujuba Mill)的果實，在我國已有3000多年的栽培歷史。紅棗色澤鮮紅、皮薄、肉厚、核小、味道甘美清香，其干制品富含多種維生素、氨基酸、多糖、粗纖維、磷、鈣、鉀等諸多營養(yǎng)保健成分，具有很高的營養(yǎng)價值，被視為良好的滋補(bǔ)品[1]。新疆南疆地區(qū)具有光熱資源充足，無霜期長，晝夜溫差大，降雨少，氣候干燥等獨(dú)特的氣候條件，為優(yōu)質(zhì)紅棗的生長提供了優(yōu)良的自然條件。

2013年在阿拉爾墾區(qū)，9月底10月初大量發(fā)生紅棗著色期表面異常褐變現(xiàn)象，典型癥狀表現(xiàn)為從紅棗臍部開始整齊的以圈狀向果柄部發(fā)展，色變與未色變部位交界明顯，變色部位較正常部位軟，后期易發(fā)生紅棗黑斑病。本研究對可能引起新疆南疆紅棗果面異常褐變的鏈格孢屬菌株進(jìn)行形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀等形態(tài)學(xué)研究，并結(jié)合18SrDNA-ITS、EF-1α、β-tubulin 、ATPase基因進(jìn)行測序和序列分析，對其分離菌株進(jìn)行鑒定。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1病樣采集

2013年從新疆阿拉爾農(nóng)場和12團(tuán)采集有典型病狀特點的病果。

1.1.2供試植株

新疆塔里木大學(xué)園藝站紅棗資源圃，4年生駿棗。

1.1.3供試培養(yǎng)基

1.1.3.1PDA培養(yǎng)基

配方：馬鈴薯：200 g，瓊脂：20 g，葡萄糖：20 g，蒸餾水：1 000 ml。

1.1.3.2PCA培養(yǎng)基

配方：馬鈴薯200 g，胡蘿卜200 g，瓊脂20 g，蒸餾水：1 000 ml。

1.2試驗方法

1.2.1組織塊分離及純化

選擇新鮮的病果，先用清水將病果表面沖洗干凈，在無菌操作臺上，用高溫滅菌的解剖刀切取發(fā)病棗果病健交界處小塊病果組織，用75%的酒精浸泡1～2 min，再用0. 1%的升汞消毒0. 5～1 min，再用無菌水沖洗3～4次，最后將小塊組織移放到PDA培養(yǎng)基平板上25℃培養(yǎng)。在培養(yǎng)菌落邊緣挑取形態(tài)比較單一的小塊菌絲塊轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)純化，純化菌株編號LF保存于PDA斜面上置4 ℃冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆肹2]。

1.2.2分離菌株致病性測定及再分離

1.2.2.1配置孢子懸浮液

將菌株LF活化后在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)5～7 d 后，向皿內(nèi)加無菌水制成孢子懸浮液。懸浮液中孢子量為10×40 倍顯微鏡下每視野20～40個分生孢子。未產(chǎn)孢的菌株純化培養(yǎng)4～5 d 時用打孔器打成直徑為3 mm 的圓形菌餅以備接種[3]。

1.2.2.2室內(nèi)接種

將著色期完好無傷的棗果用70%的酒精表面消毒，無菌水沖洗3次。用滅菌的昆蟲針刺傷后(深淺一致)，噴施孢子懸浮液，并在刺傷點貼被孢子懸浮液潤濕的滅菌濾紙，并用滅菌保鮮膜保濕后置于25℃下保濕培養(yǎng)，觀察、記錄接種結(jié)果,同時將噴施無菌水棗果作為對照，置于相同條件下保濕培養(yǎng)。

1.2.2.3田間接種

選取園藝站內(nèi)健康棗園進(jìn)行分離物田間回接。接種方法參照室內(nèi)接種，然后覆蓋滅菌濕脫脂棉，套硫酸紙袋保濕。每處理選樹上隨機(jī)10個健康果。無菌水作對照。

1.2.2.4對回接后病果再分離

回接后對接種后發(fā)病的棗果進(jìn)行病組織再分離，方法同自然病組織分離方法，判斷再分離的菌株跟接種菌株LF是否一致，判斷其是否為病原。

1.3分離菌株的形態(tài)鑒定

1.3.1病原菌的形態(tài)觀察

用直徑5mm滅菌打孔器打取菌株LF在PDA平板上25 ℃培養(yǎng)5 d后是菌落邊緣部位，將其移到PCA平板上置于25 ℃條件下培養(yǎng)。5 d后觀察菌落形態(tài)。

1.3.2產(chǎn)孢表型觀察

在比載玻片略小的濾紙中心剪約1×3 cm的長方形小孔，將其貼于載玻片上并放在鋪兩層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)一起滅菌，滅菌完成后，從培養(yǎng)在PCA上的菌落邊緣取小塊涂抹在小孔周圍，然置25 ℃，近紫外燈+日光燈，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)保濕培養(yǎng)5～7 d，在10×40倍萊卡熒光數(shù)碼顯微鏡(DM2000)下拍攝代表該菌株總體特征的產(chǎn)孢表型[4]。

1.3.3分生孢子鑒定與觀察

用直徑5 mm滅菌打孔器打取菌落邊緣部位，將其移到PCA平板置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)5～7 d后，在10×40倍萊卡熒光數(shù)碼顯微鏡(DM2000)下觀察孢子形態(tài)并測量50個分生孢子的長、寬、喙長及縱、橫隔。

根據(jù)病原菌的菌絲、菌落、分生孢子梗、產(chǎn)孢細(xì)胞、分生孢子及產(chǎn)孢表型的形態(tài)特征，查閱原始資料，鑒定到種。

1.4分離菌株的分子鑒定

采用CTAB的方法提取基因組DNA[5]。采用真菌的rDNA -ITS、EF-1α、β-tubulin基因、ATPase基因引物擴(kuò)增來鑒定病原菌。擴(kuò)增引物對及其序列見表1.

表1 PCR所需引物及其序列

rDNA -ITS 序列擴(kuò)增擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer 2. 5 μL、25 mM MgCl21. 5 μL、10 mM dNTP 0. 2 μL、10 M ITS1 1. 0 μL、10 M ITS4 1. 0 μL、5 U/L TaqDNA聚合酶0. 125 μL，DNA模版1 μL，加ddH2O至25 μL，PCR擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min[6]；EF-1α基因和β-tubulin基因的擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer 2. 5 μL、25 mM MgCl22 μL、10 mM dNTP 0. 25 μL、10 M上游引1. 0 μL、10 M 下游引物1. 0 μL、5 U/L TaqDNA聚合酶0. 25 μL，DNA模版1 μL，加ddH2O至25 μL[7]。

EF-1α基因擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min ，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。β-tubulin擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min；ATPase基因的擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer 2. 5 μL、25 mM MgCl21. 5 μL、10 mM dNTP 0. 2 μL、10 M ATPDF11. 0 μL、10 M ATPDR1 1. 0 μL、5 U/L TaqDNA聚合酶0. 3 μL，DNA模版1 μL，加ddH2O至25 μL，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

將PCR產(chǎn)物送到華大基因科技有限公司進(jìn)行測序，獲得序列后，登陸NCBI網(wǎng)站，進(jìn)行BLAST同源性比對分析，使用MEGA6.06軟件建立進(jìn)化樹，用Bootstrap對系統(tǒng)樹進(jìn)行檢驗，1 000次重復(fù)。

2結(jié)果與分析

2.1菌株的分離培養(yǎng)及致病性測定

從發(fā)病嚴(yán)重的阿拉爾周邊棗園采集病棗，于PDA培養(yǎng)基平板上分離，25 ℃下培養(yǎng)。從病棗上分離、純化共得到病菌，接種試驗后，在健康棗果上觀察到刺傷處理的開始發(fā)病，無傷接種和對照均沒有發(fā)病，其發(fā)病癥狀與自然發(fā)病的一致。因此，該病菌可以引起紅棗果實異常褐變發(fā)病，將發(fā)病棗果進(jìn)行再分離試驗，獲得了與所接種的菌種一樣的菌株。根據(jù)柯赫氏法則證明接種菌為紅棗果實異常褐變的致病菌。

圖1　紅棗表面異常褐變癥狀

2.2分離菌株的形態(tài)鑒定

2.2.1PDA培養(yǎng)基上的菌落培養(yǎng)性狀

用直徑5 mm滅菌打孔器打取菌落邊緣部位，將其移到PDA平板上置于25 ℃條件下培養(yǎng)。5～7 d后菌落圓形，邊緣整齊，中央具有明顯的淺灰與墨綠色的同心輪紋，氣生菌絲發(fā)達(dá)，呈薄層絮狀，背面呈灰色至暗青褐色。

圖2　PDA培養(yǎng)基病原菌菌落形態(tài)

2.2.2病原菌產(chǎn)孢表型觀察

從培養(yǎng)在PCA上的菌落邊緣取小塊涂抹在濾紙玻片小孔周圍，置于25 ℃，近紫外燈+日光燈，12h光照/12h黑暗循環(huán)保濕培養(yǎng)5～7 d。分生孢子梗單生，直立或彎曲，分隔，分枝或不分枝，從基面或主菌絲上生出，淡褐色至褐色，37. 15～158. 48×2. 77～6. 61 μm，平均84. 88×4. 29 μm，產(chǎn)孢方式為合軸式延伸。分生孢子單生或短鏈生，倒棍棒狀或卵形，淡褐色至褐色，表面光滑，具2～5個橫隔膜和0～2個縱斜隔膜，分隔處略縊縮，大小為20. 14～43. 87×7. 35～15. 36 μm，平均28. 67×11. 42 μm。分生孢子的短喙柱狀，淡褐色，4. 67～20. 27×2. 5～5. 43 μm，平均5. 89×3. 82 μm。根據(jù)病原菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)特征，初步鑒定該病菌為鏈格孢屬鏈格孢Alternaria alternata(Fr.：Fr.)Keissler。(如圖3)

圖3　病原菌的產(chǎn)孢表型，標(biāo)尺=50μm

2.3分子鑒定結(jié)果

2.3.1基因組DNA的提取及ITS、EF-1α、β-tubulin和ATPase序列的PCR擴(kuò)增

利用ITS、EF-1α、β-tubulin和ATPase基因引物對對基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別可以獲得大小約為530 bp、250 bp、800 bp、1200 bp左右的清晰條帶。(如圖4)

圖4　電泳圖

2.3.2基于ITS、EF-1α、β-tubulin和ATPase序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖5基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

用匍柄霉屬作為外群，對菌株LF的ITS、EF-1α、β-tubulin和ATPase序列以及下載的序列，用MEGA6. 06軟件中的Neighbour-joining方法生成系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析。

在基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株LF與下載鏈格孢屬菌株Alternaria alternata、Alternaria tenuissima、Alternaria gaisen、Alternaria brassicae、Alternaria ochroleuca、Alternaria compacta等聚在一起, 說明可以將菌株LF鑒定到鏈格孢屬，但無法鑒定到種。

圖6　基于EF-1α序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖7基于β-tubulin序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

在基于EF-1α序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株LF與Alternaria alternata聚為一類,說明菌株LF為Alternaria alternata。

在基于β-tubulin序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株LF與Alternaria alternata聚為一類,說明菌株LF為Alternaria alternata。

在ATPase系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株LF與Alternaria tenuissima( AccessJQ811984)聚在一起,但經(jīng)過堿基組成分析，Alternaria tenuissima( AccessJQ811984)應(yīng)為Alternaria alternata，因此在ATPase系統(tǒng)發(fā)育樹中也是將菌株LF鑒定為Alternaria alternata。

通過ITS、EF-1α、β-tubulin和ATPase四基因結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定，可以將菌株LF鑒定為Alternaria alternata。

3結(jié)論與討論

通過大量分離試驗，獲得了菌落形態(tài)特征較為一致的菌株，經(jīng)柯赫氏法則證明該分離菌LF即為該病害的致病菌。通過病菌培養(yǎng)形態(tài)特征觀察及鑒定、并結(jié)合18SrDNA-ITS、EF-1α、β-tubulin 、ATPase 4基因進(jìn)行測序和序列分析及特異性片段擴(kuò)增，將南疆駿棗果實著色期表面異常褐變的病原菌確定為Alternaria alternata。

參照Simmons[8]和張?zhí)煊顚lternaria屬真菌種間分類的培養(yǎng)條件，菌株在PCA+濾紙光暗交替培養(yǎng)條件下的分生孢子形態(tài)與A. alternata在自然基質(zhì)上的分生孢子形態(tài)較為一致。A.alternata在PCA+濾紙上培養(yǎng)5～7d天，形成5～10個左右孢子的主鏈，支鏈一般1～5個孢子，分生孢子20. 5～39. 0 μm×8. 0～14 μm，喙及假喙0～21. 5 μm×2. 5～4. 0 μm。在PCA上菌落灰色至暗青褐色，基內(nèi)菌絲和氣生菌絲均發(fā)達(dá)。而分離菌株在PCA平板上菌落灰色至暗青褐色，菌絲發(fā)達(dá)，就其產(chǎn)孢表型和分生孢子形態(tài)、大小而言與A. Alternata的描述基本一致。

為了使結(jié)果更具可靠性，分子生物學(xué)方法在鏈格抱菌的系統(tǒng)研究中得到越來越多的應(yīng)用,為其分類鑒定提供了DNA水平的證據(jù)[5]。應(yīng)用rDNA -ITS區(qū)序列進(jìn)化速度比較快,而且在屬間和同一種屬不同種間存在著廣泛的多態(tài)性,所以對ITS區(qū)PCR來進(jìn)行病原菌的分類鑒定已成為國際上廣泛使用的技術(shù)[9]。但是由于小孢子同源性極高，在基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，可以將菌株LF鑒定到鏈格孢屬，但無法鑒定到種; 在基于EF-1α和β-tubulin序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株LF與Alternaria alternata聚為一類,說明菌株LF為Alternaria alternata；在ATPase系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株LF與Alternaria tenuissima(AccessJQ811984)聚在一起,但經(jīng)過堿基組成分析，Alternaria tenuissima( AccessJQ811984)應(yīng)為Alternaria alternata，因此最終在ATPase系統(tǒng)發(fā)育樹中將菌株LF鑒定為Alternaria alternata。

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Identification of Alternaria Isolated from Jun Jujube with Brown Stain

Fruit Surface in Coloring Period South of Xinjiang in China

Liu Fan1Zhu Tiansheng1,2Zi Lili1Liu Zhengya1Li Long1Liu Tao1Xiong Renci1,2*

(1 College of Plant Science, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)

(2 Integrated pest management of agricultural Key Laboratory in South of Xinjiang, Alar, Xinjiang 843300)

AbstractAs the jujube fruit surface coloring period large abnormal browning, late black spot disease incidence rate was high in 2013 in the south of Xinjiang, in order to explore the cause of disease fruit browning, LF strain was isolated.It could cause similar symptoms by Koch verification , according to strain LF morphological identification, combining with the analyis of amplified ITS sequences, EF-1 alpha, beta -tubulin and ATPase four fragment after isolates extraction DNA, and constructed phylogenetic tree, the strain LF was Alternaria alternata (Fr:Fr.) Keissler by morphological identification and molecular biology identification.

Key wordsJun jujube; plantdisease; identification

中圖分類號：S-43

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2015.04.001

文章編號：1009-0568(2015)04-0001-09

通訊作者*為E-mail： xrcqwb@163.com

作者簡介：劉凡(1993-)，女，2015級本科生，研究方向為果樹病理學(xué)。E-mail：514540659@qq.com

基金項目：國家大學(xué)生創(chuàng)新項目(201410757032)；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)產(chǎn)學(xué)研重大合作科技專項(2013AA001-1)；北京市援助和田科技攻關(guān)項目(201106)。

收稿日期:2015-05-11