聶 穎裴明日欒國華

1吉林市疾病預(yù)防控制中心，吉林吉林 132001

2吉林市食品藥品檢驗所，吉林吉林 132001

3吉林市食品藥品檢驗所，吉林吉林 132001

茯苓山藥片中非法添加格列本脲的快速篩查

聶 穎1裴明日2欒國華3

1吉林市疾病預(yù)防控制中心，吉林吉林 132001

2吉林市食品藥品檢驗所，吉林吉林 132001

3吉林市食品藥品檢驗所，吉林吉林 132001

【摘要】目的 建立薄層色譜法對茯苓山藥片中非法添加化學(xué)藥品格列本脲進(jìn)行快速篩查。方法 以格列本脲對照品作對照，以三氯甲烷-甲醇（1:1）為溶劑進(jìn)行提取，硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（15:10:3）為展開劑展開，紫外燈光（365 nm）下檢視熒光斑點(diǎn)。結(jié)果 采用薄層色譜法能夠高效快速地排查茯苓山藥片中是否非法添加化學(xué)藥品格列本脲，在與格列本脲對照品色譜相應(yīng)的位置上，未顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)為陰性（樣品不含格列本脲），顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)為陽性（樣品含格列本脲）。結(jié)論 所建立的方法操作簡便，且穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，結(jié)果比較準(zhǔn)確，適用于對茯苓山藥片中的格列本脲的快速篩查。

【關(guān)鍵詞】茯苓山藥片；格列本脲；非法添加；薄層色譜

【中圖分類號】R927.1

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號】1673-5846(2015)10-0019-04

【Abstract】Objective To establish a Thin Layer Chromatography(TLC)method for rapid determination of glibenclamide illegally added in Fulingshanyao Tablets.Methods Use glyburide as comparison,Use Chloroform-methanol(1:1)as extraction solvent,Spot sample on Silica gel G thin plate,Extract with chloroform-methanol-formic acid(15:10:3), Observe Fluorescent spots under UV light(365 nm).Results TLC method can efficiently determine whether there is glibenclamide illegally added in Fulingshanyao Tablets.The result is negative if there is no fluorescent spot with the same color of glyburide in the corresponding chromatographic position(there is no glyburide in the sample),The result is positive if there is fluorescent spot with the same color of glyburide in the corresponding chromatographic position(there is glyburide in the sample).Conclusion The method established is simple, stable and reproducible,the result is accurate,and it can be used for rapid determination of glibenclamide in Fulingshanyao Tablets

idRap Determination of Glibenclamide Illegally Added in Fulinshanyao Tablets

Nie Ying Pei Mingri Luan Guohua

【Key words】Chinese yam;Glyburide;Illegally added;Thin layer chromatography

茯苓山藥片為市場上的一種降糖類保健食品，為棕黃色，味略苦。該藥品說明中標(biāo)示“本品是以茯苓、山藥、葛根、玉竹、枸杞子等二十六味名貴藥材配伍，采用高科技生物技術(shù)‘膜分離提取技術(shù)’工藝生產(chǎn)的新一代高效無毒副作用，又能對糖尿病患者健脾、益腎、補(bǔ)肝、明目、潤肺的新一代綠色純天然藥食同療制劑”。服用該藥品后能快速降低血糖，采用薄層色譜法對茯苓山藥片中是否非法添加化藥降糖成分進(jìn)行篩查分析，以多種化學(xué)降糖藥為對照檢測，鑒別結(jié)果顯示，茯苓山藥片中檢出降糖化成分格列本脲，進(jìn)一步采用高效液相色譜法（HPLC）DAD檢測器檢測驗證，其添加化學(xué)藥品的成分確實為格列本脲。格列本脲為第二代磺脲類降糖化學(xué)藥品，有較強(qiáng)的降低血糖作用，臨床適用于2型糖尿病病情較重的患者。由于急速降糖可導(dǎo)致患者產(chǎn)生嚴(yán)重低血糖，造成休克、誘發(fā)腦出血等生命危險，因此糖尿病患者應(yīng)在醫(yī)師指導(dǎo)下合理使用，以確保群眾使用安全有效。本研究采用薄層及液相色譜法對茯苓山藥片中添加化學(xué)藥品成分進(jìn)行了方法學(xué)的研究，建立薄層檢測法，使茯苓山藥片質(zhì)量可控。

1　儀器與試劑

1.1 儀器 HPLC：安捷倫1100型LC（包括脫氣機(jī)、四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器，儀器編號：YYX-ZY2-009）；分光光度計：Agilent UV-8453型紫外分光光度計（美國安捷侖公司，儀器編號：YZW-HX-001）；紫外光燈；超聲清洗器：JCX-600Z（山東濟(jì)寧超聲電子儀器廠，儀器編號：YZW-HX-003）；電子天平：METTLER AE-240型（儀器編號：YYT-ZY2-008）

1.2 材料 實驗樣品：茯苓山藥片，美國希美（國際）生物集團(tuán)·希美（鄭州）生物技術(shù)有限公司，規(guī)格：300 mg/片，60片/盒，鋁塑板，批號：20110301、20120109；格列本脲對照品：中國食品藥品生物制品檢定研究院，批號：100135-200404（供含量測定使用），規(guī)格：50 mg/支；薄層板：硅膠G薄層快檢板規(guī)格5 cm×10 cm（天津，由中檢所提供）、硅膠G預(yù)制板：規(guī)格10 cm×10 cm（青

島海洋化工廠）。

1.3 試劑 甲醇（加拿大）色譜純；甲醇（天津市化學(xué)試劑，批號：20120523）分析純；三氯甲烷（北京化學(xué)試劑廠，批號：20120523）分析純；甲酸（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號：20120123）分析純；乙酸乙酯（天津化學(xué)試劑廠，批號：20121221）；石油醚（天津化學(xué)試劑有限公司，批號：20110728）；乙酸銨（天津化學(xué)試劑有限公司，批號：20121020）分析純；乙酸（北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司，批號：20120622）分析純；實驗用水為純化水。

2　方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜法（TLC）

2.1.1 溶液的制備 供試品溶液的制備：取茯苓山藥片5片，研細(xì)，稱取細(xì)粉約1 g（相當(dāng)3片重量），加提取溶劑甲醇-三氯甲烷（1:1）5 ml，超聲提取10 min，靜置，傾取上清液作為供試品溶液。

對照品溶液的制備：取格列本脲對照品適量約25mg，精密稱定，置于10 ml容量瓶中，加溶劑甲醇-三氯甲烷（1:1）約5 ml，超聲10 min使對照品溶解，再加甲醇-三氯甲烷（1:1）至刻度，制成每1毫升含2.5 mg的對照品溶液。

陰性對照溶液的制備：取陰性對照樣品（未加格列本脲）5片，研細(xì)，稱取細(xì)粉約1 g（相當(dāng)3片重量），加甲醇-三氯甲烷（1:1）5 ml，超聲提取10 min，靜置，傾取上清液作為供試品陰性對照溶液。

2.1.2 薄層鑒別方法粗放性考察

2.1.2.1 薄層板的比較 ①薄層快檢板（天津，由中檢所提供），按照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄ⅥB）實驗，吸取上述配制的3種溶液各5 μl分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，通過三氯甲烷-甲醇-甲酸（15:10:3）展開劑展開，取出晾干，立即置于紫外光燈（254 nm）下檢視。②薄層預(yù)制板（青島海洋化工廠），吸取上述配制的3種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一的硅膠G薄層板上，通過三氯甲烷-甲醇-甲酸（15:10:3）為展開劑展開，取出晾干，立即置于紫外光燈（254 nm）下檢視。兩種板比較結(jié)果顯示：供試品（非法添加格列本脲）溶液所顯熒光斑點(diǎn)顏色和位置與對照品溶液所顯的熒光斑點(diǎn)相同，斑點(diǎn)清晰，分離度較好?？鞕z板、預(yù)制板兩種薄層板的分離效果相似，區(qū)別不大（Rf值適中）；快檢板比預(yù)制板點(diǎn)樣量少，快檢板層析展開比較快，節(jié)省實驗時間。

2.1.2.2 展開系統(tǒng)的優(yōu)選 參考有關(guān)資料[1-2]，在降糖類化學(xué)藥品鑒別法中常用薄層展開系統(tǒng)進(jìn)行比較：展開劑①石油醚（90～120℃）-乙酸乙酯-三氯甲烷-甲醇-甲酸（10:10:6:2:0.5），展開劑②三氯甲烷-甲醇-甲酸（15:10:3），分別取格列本脲、格列吡嗪、格列奇特、格列喹酮為對照，對照品之間及樣品的分離度為判定指標(biāo)，分別在兩個展開系統(tǒng)下進(jìn)行實驗比較。結(jié)果顯示：對照品之間能夠很好地分離，樣品在兩個展開系統(tǒng)中的區(qū)別不大，兩種展開系統(tǒng)下展開均可行，以展開劑②結(jié)果更佳。故選三氯甲烷-甲醇-甲酸（15:10:3）為展開劑。

2.1.2.3 實驗環(huán)境的考察 在3種不同溫度（T）、相對濕度（RH）環(huán)境下比較：分別在高溫（T 35℃、RH 50%）、低溫（T 12℃、RH 25%）、室溫（T 20℃、RH 40%）的條件下對該品種進(jìn)行實驗考察。結(jié)果顯示：通過采用不同溫度、相對濕度等綜合考察薄層鑒別溫度越高，對照品、樣品中格列本脲絕對Rf值越大，在3種不同溫、相對濕度下比較存在一定差異。高溫、室溫實驗條件下分離度很好，斑點(diǎn)清晰；而低溫下分離度較差，因此需控制TLC的實驗條件，才能保證較好的重現(xiàn)性，保證快檢結(jié)果的準(zhǔn)確。

2.1.3 薄層實驗方法 薄層板：硅膠G254 nm薄層板（快檢板）5 cm×10 cm，展開劑：三氯甲烷-甲醇-甲酸（15:10:3），點(diǎn)樣量：吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各5 μl，檢視：置紫外光燈（254 nm）下檢視。結(jié)果顯示：供試品溶液的色譜中，在與格列本脲對照品色譜相應(yīng)的位置上，不得顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對照樣品的色譜中，在與格列本脲對照品色譜相應(yīng)的位置上，未見相同顏色的熒光斑點(diǎn)。茯苓山藥片供試品色譜中，在與格列本脲對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，說明樣品中可能添加化學(xué)降糖藥物格列本脲。經(jīng)液相色譜法進(jìn)一步驗證此成分確實為格列本脲。見圖1。

圖1　茯苓山藥片薄層鑒別色譜圖

2.2 HPLC

2.2.1 格列本脲對照品貯備溶液 精密稱取格列本脲對照品25 mg，置于25 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成每1毫升含1 mg的對照品貯備溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備 取上述格列本脲對照品貯備溶液5 ml，置于50 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度制成濃度為每1毫升含0.1 mg對照品溶液。

2.2.3 樣品溶液的制備 取茯苓山藥片10片，研細(xì)，稱取約1.5 g（相當(dāng)5片重量，即1次服用量）細(xì)粉，精密稱定，加甲醇30 ml，超聲處理30 min，

濾過，取濾液置蒸發(fā)皿中，將其置于水浴上蒸干，殘渣加甲醇適量溶解，轉(zhuǎn)移至25 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為樣品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取陰性對照（未含格列本脲樣品）10片，研細(xì)，取約1.5 g（相當(dāng)5片重量）細(xì)粉，精密稱定，加甲醇30 ml超聲處理30 min，濾過，濾液置蒸發(fā)皿中將其置于水浴上，蒸干，殘渣加甲醇適量溶解，轉(zhuǎn)移至25 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為陰性對照樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

2.3.1 檢測波長的確定 取上述配制的格列本脲對照品貯備溶液5 ml，置于50 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度制成濃度為每1毫升含0.1 mg對照品溶液，用紫外分光光度儀在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果顯示：格列本脲對照品溶液在230 nm處有最大吸收。根據(jù)光譜掃描結(jié)果及參考有關(guān)格列本脲文獻(xiàn)[3-5]，采用HPLC檢測茯苓山藥片中格列本脲，選用最大吸收波長λmax=230 nm作為檢測波長。見圖2。

2.3.2 干擾實驗 取陰性對照（未含格列本脲）樣品，加格列本脲對照品適量，加甲醇制成每1毫升含0.1 mg格列本脲的樣品溶液，濾膜濾過，即得，自動進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示無干擾。

參考文獻(xiàn)2.3.3 流動相的選擇[1-2]采用A：0.02 mol/L磷酸二氫鉀（pH 3.5）-甲醇（30:70）為流動相，B：0.05 mol/L乙酸銨-乙腈為流動相，進(jìn)行梯度洗脫，流動相B分離效果好，保留時間適度，故選擇流動相B為本法的流動相。理論板數(shù)（N）的確定，采用色譜柱：①Apollo C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），②Shim-pack VP-ODS C18（150 mm ×4.6 mm，5 μm），③Alltima ODS C18（150 mm ×4.6 mm，5 μm），流速：0.8 ml/min；3種色譜柱比較結(jié)果顯示，色譜柱③條件下，供試品中格列本脲保留時間、理論板數(shù)以格列本脲峰計理論板數(shù)（N）大于2000時，分離度（R）≥1.5。故理論板數(shù)以格列本脲峰計應(yīng)不低于1000。

2.3.4 液相色譜條件 色譜柱：Apollo C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm），流動相：A相:乙腈，B相：0.05 mol/L乙酸銨-乙腈（梯度洗脫），進(jìn)樣量：20 μl，柱溫：30 ℃，流速：0.8 ml/min，檢測波長：230 nm。依照上述方法，測得格列本脲對照品溶液、樣品溶液。

2.3.5 檢測結(jié)果 取格列本脲對照品溶液、樣品溶液（非法添加格列本脲）及陰性對照樣品溶液（未含格列本脲）各20 μl，分別注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行實驗，記錄色譜圖。陰性樣品（未含加格列本脲）溶液色譜圖在與格列本脲對照品色譜峰保留時間相應(yīng)的位置上未出現(xiàn)色譜峰。樣品（非法添加格列本脲）溶液主峰保留時間與格列本脲對照品色譜峰保留時間相同；經(jīng)二極管陣列（DAD）檢測器檢測驗證，樣品的確非法添加了格列本脲（圖3～5）。

圖2　格列本脲對照品紫外光譜圖

圖3　樣品陰性對照色譜圖

圖4　對照品格列本脲色譜圖

圖5　樣品溶液色譜圖

3　討論

3.1 提取溶劑的選擇 甲醇、甲醇-三氯甲烷（1:1）兩種溶媒進(jìn)行提取。薄層檢驗結(jié)果顯示，甲醇-三氯甲烷（1:1）提取液斑點(diǎn)較大，相對提取較完全，故選甲醇-三氯甲烷（1:1）為提取溶劑。

3.2 為提高快檢方法的適用性，在薄層色譜法中對實驗材料及條件進(jìn)行類粗放性考察

3.2.1 薄層板的比較結(jié)果 快檢板與預(yù)制板兩種薄層板的分離效果均好（Rf值適中）；但快檢板比預(yù)制板點(diǎn)樣量少，層析展開比較快，節(jié)省實驗時間，更適用于車載快檢篩查。

3.2.2 兩種展開系統(tǒng)優(yōu)選 展開劑①和展開劑②的分離度均很好，兩種展開系統(tǒng)下展開均可行。因展開劑②三氯甲烷-甲醇-甲酸（15:10:3）所用試劑較少，故快檢方法選三氯甲烷-甲醇-甲酸（15:10:3）為展開劑。

3.2.3 3種不同溫度、相對濕度環(huán)境薄層效果比較分別在高溫、低溫、室溫的條件下進(jìn)行實驗考察，結(jié)果顯示高溫、室溫實驗條件下分離度很好，斑點(diǎn)清晰，而低溫下分離度較差，因此需控制TLC的實驗條件，才能保證較好的重現(xiàn)性，以保證快檢結(jié)果的準(zhǔn)確。

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