呂春華 何洵 漆月 舒展 黃楊波

（1，新疆維吾爾自治區(qū)阿勒泰地區(qū)動(dòng)物疾病控制與診斷中心 836500；2，新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 830011；3，廣州悅洋生物技術(shù)有限公司 510300）

膠體金條在牛結(jié)核病防治中的應(yīng)用

呂春華1何洵2漆月3舒展1黃楊波1

（1，新疆維吾爾自治區(qū)阿勒泰地區(qū)動(dòng)物疾病控制與診斷中心 836500；2，新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 830011；3，廣州悅洋生物技術(shù)有限公司 510300）

牛結(jié)核病是一種由牛分枝桿菌引起的慢性、消耗性人獸共患病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織 （OIE）將牛結(jié)核病列入B類動(dòng)物疫病，我國也在二類動(dòng)物疫病中將其收錄。該病對(duì)奶牛生產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害人類健康，威脅社會(huì)公共衛(wèi)生安全。因此，科學(xué)防治牛結(jié)核病對(duì)于畜牧業(yè)發(fā)展、人類健康和公共衛(wèi)生安全都具有重大意義。我們采用膠體金試紙條對(duì)該地區(qū)的牛群進(jìn)行牛結(jié)核病檢疫，及時(shí)撲殺陽性牛，積累了部分膠體金試紙條在牛結(jié)核病防治中的應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)。

膠體金試紙條；牛結(jié)核??；防治

近年來結(jié)核病 （Tuberculosis）在人間的感染率上升。全國新發(fā)活動(dòng)性肺結(jié)核病患者高達(dá)145萬人。其中傳染性肺結(jié)核患者65萬人。約有13萬人因此死亡[1]。研究證實(shí)有10%的人結(jié)核病是由牛分枝桿菌 （Mycobacterium Bovis。M.Bovis）引起的。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織 （OIE）在第七次專家委員會(huì)報(bào)告中指出：在那些牛結(jié)核病 （Bovine Tuberculosis。bBT）的國家。除非撲滅牛結(jié)核病。否則人類結(jié)核病的控制就不能成功。目前隨著國際貿(mào)易、動(dòng)物及動(dòng)物制品的市場(chǎng)流通和人們對(duì)奶制品需求量的增加。牛結(jié)核病必將得到養(yǎng)殖場(chǎng)和政府的高度重視。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)。全世界有5000萬頭牛感染了牛分枝桿菌。每年直接造成經(jīng)濟(jì)損失達(dá)30多億美元[2]。

牛結(jié)核病是由牛分枝桿菌引起的一種慢性、消耗性人獸共患病。該病臨床癥狀與受害器官相對(duì)應(yīng)。肺結(jié)核時(shí)病牛逐漸消瘦并伴有咳嗽和呼吸困難；乳房結(jié)核時(shí)乳房有腫塊。產(chǎn)奶量減少或停止泌乳。且常波及乳房上淋巴結(jié)。嚴(yán)重者甚至乳腺萎縮或腫大、變硬；生殖器官結(jié)核時(shí)奶牛表現(xiàn)為屢配不孕和流產(chǎn)；腸結(jié)核時(shí)病牛食欲、消化和營養(yǎng)物質(zhì)吸收紊亂。便秘和腹瀉交替出現(xiàn)等[3-5]。

1 牛結(jié)核病的診斷方法

牛感染牛分枝桿菌后的臨床表現(xiàn)并不明顯。所以很難依靠臨床診斷鑒別出感染分枝結(jié)核桿菌的病牛。所以常需要用一些特殊的檢測(cè)方法進(jìn)行診斷。這不僅有利于確診。更可查出隱性病牛。目前常用的診斷方法大體上可分為3類：細(xì)菌學(xué)檢查方法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)檢測(cè)方法。由于細(xì)菌學(xué)和分子生物學(xué)的方法在目前都需要在實(shí)驗(yàn)室完成。且程序繁雜。時(shí)間較長(zhǎng)。一般不常用。本文將介紹幾種常用免疫學(xué)方法。

1.1 結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)

結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn) （Tuberculin skin test。TST）是OIE迄今為止唯一推薦的牛結(jié)核病的診斷方法。該方法主要是用牛結(jié)核菌素 （PPD）對(duì)牛進(jìn)行皮內(nèi)接種。于72～96h后觀察接種部位腫脹程度。通過游標(biāo)卡尺量皮厚的方法進(jìn)行判定結(jié)果。該方法有很多弊端。首先是注射的PPD對(duì)牛個(gè)體反應(yīng)有差異。結(jié)果判定靠檢疫人員測(cè)量皮膚厚度。易造成人為誤差。操作繁瑣。費(fèi)時(shí)費(fèi)力。最大缺點(diǎn)是缺乏時(shí)效性；其次TST的試驗(yàn)結(jié)果假陽性率較高、非特異性高。但牛感染非致病性分枝桿菌或使用某些藥物治療就會(huì)造成假陽性結(jié)果。在相當(dāng)數(shù)量的結(jié)核菌素試驗(yàn)陽性牛中。既找不出特征病變。又不能分離出結(jié)核菌?；騼H僅分離出非典型的分枝桿菌。重復(fù)檢疫時(shí)陽性率下降。而且妊娠母牛和細(xì)胞免疫反應(yīng)低下的重癥患牛檢出率均很低；最后TST陽性僅能表明在過去某一時(shí)間曾經(jīng)發(fā)生過的一次結(jié)核菌感染。它無法證明目前的結(jié)核菌感染是否為活動(dòng)的?；騼H為在機(jī)體的某處有活的結(jié)核菌存在[6。7]。綜上原因使得該方法已成為基層檢疫中捕殺政策難以執(zhí)行及奶牛場(chǎng)難以凈化的直接原因。因此有必要開展其他的輔助診斷。以更準(zhǔn)確地判斷結(jié)核病的感染情況。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （ELISA）

ELISA以其簡(jiǎn)單、方便、特異、敏感的特點(diǎn)深受廣大科技工作者的喜歡。1976年Nassau首次將ELISA方法用于檢測(cè)牛血清中牛結(jié)核病抗體。隨后各國學(xué)者也陸續(xù)開始了牛結(jié)核病抗體檢測(cè)ELISA方法的研究[8]?，F(xiàn)在已有像韓國安捷（Bionote）公司生產(chǎn)的牛結(jié)核病抗體檢測(cè)ELISA試劑盒出售。在牛結(jié)核病免疫學(xué)試驗(yàn)中。ELISA作為TST的補(bǔ)充試驗(yàn)對(duì)于鑒別陰性和假陰性反應(yīng)具有重要作用。

1.3 γ-干擾素診斷法

牛在感染牛分枝桿菌后會(huì)產(chǎn)生致敏的淋巴細(xì)胞。當(dāng)這些致敏細(xì)胞在體外受到結(jié)核菌素刺激后就會(huì)釋放大量的γ-干擾素 （IFN-γ）。再通過ELISA方法檢測(cè)這些特異的IFN-γ來判斷牛是否感染牛結(jié)核。現(xiàn)也有商品化的試劑盒。因?yàn)镮FN-γ診斷法的敏感性和特異性較高。能鑒別出早期感染牛分枝桿菌的牛。降低了傳染的風(fēng)險(xiǎn)；所以許多國家已在2000年世界牛分枝桿菌會(huì)議后使用IFN-γ診斷法監(jiān)測(cè)牛群。但I(xiàn)FN-γ診斷法最大的缺點(diǎn)是一般的基層實(shí)驗(yàn)室難以完成。只有在科研院所或大學(xué)教育機(jī)構(gòu)作為科研項(xiàng)目才開展此項(xiàng)工作。進(jìn)行時(shí)間也較長(zhǎng)。完成難度也較大。

1.4 膠體金試紙條

膠體金試紙條是一種運(yùn)用膠體金免疫層析 （Gold immunochromatography assay。GICA）技術(shù)來檢測(cè)藥物、毒品、激素、病原體及其抗體等物質(zhì)的簡(jiǎn)單、便捷、特異、靈敏的檢測(cè)工具。GICA技術(shù)是在膠體金技術(shù)、ELISA、免疫層析技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)、乳膠凝集試驗(yàn)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種快速、敏感的免疫檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)與繼熒光標(biāo)記技術(shù)、酶標(biāo)記技術(shù)和放射性同位素標(biāo)記技術(shù)一起成為了現(xiàn)在最重要的四大免疫標(biāo)記技術(shù)[9]。以牛分枝桿菌特有的抗原蛋白作為捕獲抗原的膠體金試紙條不僅擁有不亞于其它免疫學(xué)診斷方法的敏感性和特異性。還有比其它免疫學(xué)診斷方法操作更簡(jiǎn)單、耗時(shí)少的優(yōu)點(diǎn)。深受廣大基層獸醫(yī)或養(yǎng)殖場(chǎng)的歡迎。筆者在使用了韓國安捷 （Bionote）公司的牛結(jié)核病抗體快速檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了對(duì)牛群結(jié)核病的檢疫。從中獲得了不少檢測(cè)牛結(jié)核病方面的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)。

2 應(yīng)用膠體金試紙條檢測(cè)牛結(jié)核病

牛結(jié)核病是我國政府要求必須 “檢疫—撲殺”的動(dòng)物疫病之一。但由于我國對(duì)撲殺病牛的財(cái)政補(bǔ)貼不高。造成養(yǎng)殖場(chǎng)自主承擔(dān)損失比例偏高。所以不愿意配合檢疫而出現(xiàn)不檢或謊報(bào)、漏報(bào)的現(xiàn)象。再加之不同單位機(jī)構(gòu)對(duì)牛結(jié)核病的流行病學(xué)調(diào)查的采樣方式和檢測(cè)方法不同的是我國牛結(jié)核病的流行現(xiàn)狀數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。但可以明確我國的牛結(jié)核病疫情是呈蔓延上升的。我國在牛結(jié)核病防治中主要存在以下幾個(gè)問題：一是對(duì)牛結(jié)核病的防治和凈化沒有確切的政策規(guī)劃。二是缺乏合理科學(xué)的防治手段或技術(shù)。三是畜牧行業(yè)從業(yè)人員的整體素質(zhì)不高。四是早先的撲殺補(bǔ)貼標(biāo)準(zhǔn)低。不符合現(xiàn)在的市場(chǎng)行情。五是缺乏對(duì)牛群流動(dòng)的有力監(jiān)管及健全的牛群流動(dòng)可追溯系統(tǒng)。六是對(duì)野生動(dòng)物結(jié)核病的關(guān)注度不夠[10]。

在實(shí)行 “檢疫—撲殺”過程中。首先要解決的是如何快速、準(zhǔn)確的診斷出牛結(jié)核病病牛。筆者在近些年開始。實(shí)施膠體金試紙條示范點(diǎn)檢疫工作。選擇三個(gè)縣市的20個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)作為應(yīng)用示范點(diǎn)。采用韓國安捷 （Bionote）公司的牛結(jié)核病抗體快速檢測(cè)試劑盒對(duì)5496頭牛進(jìn)行了檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見附表。

在實(shí)踐中膠體金試紙條表現(xiàn)出了讓基層獸醫(yī)人員欣喜的性能。應(yīng)用膠體金試紙條檢測(cè)牛結(jié)核病抗體整個(gè)過程僅需幾分鐘。遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于TST方法的72h。更不需要注射PPD后回訪養(yǎng)殖場(chǎng)測(cè)量皮厚。省時(shí)省力。像阿勒泰地區(qū)這樣每年要做上萬頭牛結(jié)核病檢疫的養(yǎng)殖大區(qū)。若全部采用費(fèi)時(shí)費(fèi)力的TST方法進(jìn)行牛結(jié)核病檢疫。獸醫(yī)檢疫人員的工作就相當(dāng)繁重。難免就會(huì)有人為造成的檢疫結(jié)果誤差、數(shù)據(jù)不準(zhǔn)、謊報(bào)、漏報(bào)的現(xiàn)象等問題；此時(shí)。膠體金試紙條就是一個(gè)很好的解決問題的工具。

在試點(diǎn)進(jìn)行膠體金試紙條檢疫牛結(jié)核病的過程中也遇到了很多麻煩。比如養(yǎng)殖場(chǎng)人員和基層獸醫(yī)對(duì)膠體金技術(shù)不了解。對(duì)試驗(yàn)準(zhǔn)確性產(chǎn)生懷疑。所以我們?cè)卩l(xiāng)鎮(zhèn)站對(duì)專業(yè)技術(shù)骨干進(jìn)行培訓(xùn)。通過對(duì)基層技術(shù)人員的培訓(xùn)和農(nóng)牧民的科普培訓(xùn)。在明確了膠體金試紙條對(duì)牛結(jié)核病的檢測(cè)原理和實(shí)際效果后。我們還鼓勵(lì)農(nóng)牧民自己購買膠體金試紙條進(jìn)行自家牛群的日常牛結(jié)核病監(jiān)控?，F(xiàn)在已有部分養(yǎng)殖場(chǎng)主在外地買牛時(shí)攜帶膠體金試紙條對(duì)欲購牛進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。確保自己的養(yǎng)殖場(chǎng)購買、引進(jìn)健康牛群。

3 總結(jié)與討論

我們?cè)谂５慕Y(jié)核病防治工作中應(yīng)用膠體金試紙條作為檢測(cè)工具。得到了積極的肯定。實(shí)踐證明膠體金試紙條在牛結(jié)核病檢測(cè)中比TST、IFN-γ診斷法、ELISA等方法更方便、更快捷、更適合于基層。我國在防治牛結(jié)核病中比較大的一個(gè)瓶頸問題就是缺乏有效的牛流通市場(chǎng)規(guī)范檢疫體系。往往沒有做好檢疫工作。如果我們?cè)谫徺I、引進(jìn)牛群過程中運(yùn)用膠體金試紙條作為現(xiàn)場(chǎng)診斷工具?；蛟S就能大大減少結(jié)核病牛的流通；相信這會(huì)成為一個(gè)防治牛結(jié)核病的有效方法。當(dāng)然。膠體金試紙條并不是那么完美。前文已經(jīng)介紹了膠體金試紙條的原理是依靠試紙條上的抗原蛋白去檢測(cè)牛結(jié)核抗體。針對(duì)的是牛感染結(jié)核中后期的體液免疫階段所產(chǎn)生的抗體；但在牛感染結(jié)核的前期。機(jī)體主要是以細(xì)胞免疫為主。此時(shí)膠體金試紙條就不一定能檢測(cè)到抗體。而針對(duì)牛結(jié)核病早期感染的IFN-γ診斷法就是一個(gè)很好的補(bǔ)充。因此。在牛結(jié)核病防治中要將幾種診斷方法以科學(xué)合理的方式結(jié)合起來。做到最快速、最準(zhǔn)確的診斷。同時(shí)。政府應(yīng)該出臺(tái)有活力的符合市場(chǎng)規(guī)律的經(jīng)濟(jì)補(bǔ)償政策。以便于及時(shí)發(fā)現(xiàn)陽性牛并撲殺；規(guī)范牛流動(dòng)可追溯系統(tǒng)。杜絕病牛的隨意流通。組織基層從業(yè)人員參加科普培訓(xùn)。增加基層獸醫(yī)及養(yǎng)殖場(chǎng)人員的防病、防控意識(shí)。更重要的是要培養(yǎng)疫病檢測(cè)意識(shí)、提高疫病檢測(cè)意識(shí)。將政府為主的例行監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)變?yōu)轲B(yǎng)殖場(chǎng)自身的日常檢測(cè)。

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呂春華 （1958-），男，農(nóng)業(yè)推廣研究員，長(zhǎng)期從事動(dòng)物疫病防控及新技術(shù)示范應(yīng)用推廣工作。