林太鳳，趙夢柯，王妍鳴，李 想，宋梓慧，王惠琴，鄭大威

(1.北京工業(yè)大學生命科學與生物工程學院，北京 100124；2.北京市飲料及食品添加劑質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，北京 100124)

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氨基酸檢測技術(shù)研究進展

林太鳳1,2，趙夢柯1，王妍鳴1，李 想1，宋梓慧1，王惠琴1,2，鄭大威1,2

(1.北京工業(yè)大學生命科學與生物工程學院，北京 100124；2.北京市飲料及食品添加劑質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，北京 100124)

氨基酸是含有氨基和羧基的一類有機化合物的統(tǒng)稱，是蛋白質(zhì)的基本組成單位，與生物的生命活動有著密切的關(guān)系，因此有越來越多的研究者開始對氨基酸進行研究。目前，氨基酸檢測的研究方法有很多種，包括分光光度法、氣相色譜法、液相色譜法等。

1紫外-可見分光光度法

紫外-可見分光光度法是根據(jù)物質(zhì)對光選擇吸收的特性，通過測定物質(zhì)在特定波長或一定波長范圍內(nèi)各不相同的吸光度，對物質(zhì)進行定性分析及定量測定。該法被廣泛應(yīng)用于食品品質(zhì)檢測中。高小紅等[1]為檢測茶葉質(zhì)量，用熱水萃取茶氨酸，并用濃鹽酸將其水解為乙胺，采用可見光分光光度法間接測得茶氨酸含量；黃曉德等[2]以茚三酮為衍生劑對蘆筍莖葉中的游離氨基酸進行測定。此外，梁新紅等[3]也建立了采取分光光度法對葡萄酒中的瓜氨酸的定量分析方法，以檢測葡萄酒質(zhì)量。紫外-可見分光光度法只能測定一種或一類氨基酸的總量，并不能進行氨基酸的分離分析。

2氣相色譜法

氣相色譜法(GC)是一種對易揮發(fā)而高溫不分解的化合物進行分離與分析的色譜技術(shù)，具有分辨率高、峰容量大、靈敏度高、分析時間短、可靠性強的特點[4]。GC在食品質(zhì)量檢測、氨基酸分析中有廣泛應(yīng)用。田良良等[5]對蝦中有機氯農(nóng)藥的殘留進行檢測。王靜萍[6]建立了采用大口徑毛細管色譜柱聯(lián)用氫火焰離子化檢測器的氣相色譜法，對食用菌中的氨基酸進行測定。隨著質(zhì)譜檢測技術(shù)的發(fā)展，采用GC與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以對氨基酸進行快速檢測。張佳等[7]采用GC與質(zhì)譜的聯(lián)用技術(shù)對茶葉中游離氨基酸進行檢測，建立了更加簡便、準確的氨基酸檢測方法。Kaspar等[8]采用衍生法對33種氨基酸進行了GC-MS檢測。通過比較不同色譜柱的分離能力，建立了10 min內(nèi)快速檢測33種氨基酸的GC-MS法。

3高效液相色譜法

高效液相色譜法是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種色譜方法，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、生化、石油、化工、環(huán)境衛(wèi)生和食品等領(lǐng)域[9]。

3.1衍生法紫外可見檢測器(UV)是高效液相色譜法檢測中最常用的檢測器之一，常用于氨基酸的分析檢測。但是，由于大多數(shù)氨基酸不含有生色團，采用UV或熒光檢測器對其進行檢測時往往需要對樣品進行衍生化反應(yīng)。

3.1.1柱后衍生法。柱后衍生法就是將氨基酸經(jīng)陽離子交換色譜柱分離后，再與衍生劑反應(yīng)。氨基酸分析儀就是基于高效陽離子交換色譜-柱后茚三酮衍生法形成的，是目前氨基酸檢測最常用的方法之一。凌云等[10]使用氨基酸分析儀對生物蛋白氨基酸檢測方法進行研究，檢測了生物蛋白中的18種氨基酸。吳潔婷等[11]使用氨基酸自動分析儀對山西老陳醋的氨基酸種類和含量進行分析，檢出16種氨基酸，并通過比較其他食醋中氨基酸含量，發(fā)現(xiàn)山西老陳醋風味獨特的原因。張海濤等[12]也使用氨基酸分析儀對蘋果醋和蘋果汁進行氨基酸含量分析，研究蘋果醋在發(fā)酵過程中生成的氨基酸種類。

氨基酸分析儀具有操作簡單、自動化高、重復性好等優(yōu)點，在雙波長下能同時檢測一級和二級氨基酸，特別適用于批量樣品中常見氨基酸的檢測。但是，由于柱后衍生法的反應(yīng)條件要求較高, 氨基酸分析儀需附設(shè)加溫衍生裝置，儀器造價高且專一性強。此外，國內(nèi)使用較多的是進口儀器。儀器所用的緩沖溶液流動相因配制較復雜且對試劑要求較高而未國產(chǎn)化，因此分析費用較高。

3.1.2柱前衍生法。常用的柱前衍生的衍生劑主要有鄰苯二甲醛(OPA)[13]、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)[14-15]、2,4-二硝基氟苯(DNFB)[16-17]、異硫氰酸苯酯(PITC)[18]、丹磺酰氯(Dansyl-Cl)[19-20]、6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯(AQC)[21-23]。這些衍生試劑可適用于紫外可見光檢測器和熒光檢測器，且有著各自的優(yōu)點和缺點(表1)。

表1　幾種氨基酸衍生試劑比較[13-25]

此外，對甲氧基苯磺酰氯(MOBS-Cl )是較有發(fā)展前景的衍生劑，具有衍生條件溫和、操作簡單、衍生反應(yīng)重復性好、衍生產(chǎn)物無需避光且較穩(wěn)定等優(yōu)點，可以同時測定17種氨基酸[24]。咔唑-9-乙基氯甲酸酯(CEOC)也可以作為氨基酸的衍生劑。由于CEOC分子內(nèi)引入一個含孤電子對的氮原子，加強了分子的共軛體系，強化了熒光反射強度，檢測靈敏優(yōu)于AQC和FMOC[25]。

相對于柱后衍生，柱前衍生法對儀器的要求相對更低、分析更加快速且靈敏度高。但是，柱前衍生化形成的副產(chǎn)物有可能會干擾色譜分離，影響分析檢測的重復性，難以實現(xiàn)自動化。因此，如果解決了柱前衍生的重復性，那么氨基酸的柱前衍生檢測技術(shù)會得到更迅速的發(fā)展。

3.2非衍生法在使用高效液相色譜聯(lián)用紫外或熒光檢測器時，待測樣品需衍生化，但是衍生步驟繁瑣、操作復雜、耗時較長。因此，氨基酸的直接檢測技術(shù)的開發(fā)、應(yīng)用備受關(guān)注?，F(xiàn)有2種新的檢測技術(shù)可以對樣品進行直接檢測，即積分脈沖安培檢測技術(shù)(IPAD)和蒸發(fā)光散射檢測技術(shù)(ELSD)。

3.2.1IPAD。這是近年來出現(xiàn)的一種可以直接檢測氨基酸的新技術(shù)。該技術(shù)無繁瑣的衍生步驟，只需將樣品稀釋到適當濃度后即可直接測定，且具有較高的準確度和靈敏度[8]，在食品、煙草、醫(yī)藥等行業(yè)樣品中氨基酸檢測開始得到應(yīng)用。Thiele等[26]建立了同時檢測食品中21種氨基酸的HPLC-IPAD方法，方法簡單、快速、準確。于宏曉等[27]優(yōu)化了煙草中游離氨基酸檢測的IC-IPAD方法，成功檢測了18種游離氨基酸。吳伶俐等[28]采用IPAD技術(shù)對榴蓮中的17種氨基酸進行了檢測。梁寶愛[28-29]采用IPAD對食醋中的18種氨基酸進行了檢測，檢出限均小于0.37 μmol/L，回收率>85.0%，方法快速、可靠。于泓等[30]對該方法進行了優(yōu)化，并且測定氨基酸注射液中的17 種氨基酸和葡萄糖，在優(yōu)化的梯度淋洗條件和積分脈沖安培檢測條件下，樣品加標回收率為88.3 %～104.6%，結(jié)果可信度高。梁立娜等[31]還采用該方法對注射液中的氨基酸進行了分析。

3.2.2蒸發(fā)光散射檢測技術(shù)(ELSD)。蒸發(fā)光散射檢測技術(shù)不同于紫外和熒光檢測器。ELSD的響應(yīng)不依賴于樣品的光學特性，任何揮發(fā)性低于流動相的樣品均能被檢測，不受其官能團的影響，解決了常見于傳統(tǒng)高效液相色譜檢測方法中的難點，可用于氨基酸的直接檢測。王玉紅等[32]利用蒸發(fā)光散射檢測技術(shù)對20種未衍生的氨基酸進行了直接檢測，氨基酸的質(zhì)量濃度在30～300 mg/L范圍內(nèi)時其峰面積的對數(shù)值與進樣質(zhì)量的對數(shù)值呈良好的線性相關(guān)性，檢出限在 24～100 ng之間，加標回收率為90.6%～106.0%。該方法操作簡便快速、準確可靠。鄢丹等[33]利用該方法測定了阿膠中的17種氨基酸，加樣回收率為93.5%～104.8%，最低檢測限在18.2～54.6 mg/L之間。

4液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法

近幾年，液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)得到飛速發(fā)展。HPLC-MS集液相色譜對復雜基體化合物的高分離能力和質(zhì)譜獨特的選擇性、靈敏度、相對分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)信息于一體，被廣泛應(yīng)用于食品、生物、醫(yī)藥、環(huán)境等領(lǐng)域[34]。HPLC-MS法可以不對氨基酸進行衍生，方法簡單、快速，尤其是質(zhì)譜不同定量掃描模式的開發(fā)，使得HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)得到越來越多氨基酸分析研究者的青睞，在煙草、中藥、真菌菌絲、果汁等樣品中氨基酸分析研究都得到了應(yīng)用。Chen等[35]采用HPLC-MS法在20min內(nèi)成功地對人尿液中20種氨基酸進行分析。劉肖肖等[36]建立了同時測定蟲生真菌菌絲中16種游離氨基酸液相色譜-電噴霧飛行時間質(zhì)譜法，并對蟲生真菌菌絲中16種游離氨基酸進行了定性、定量分析。隨著串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，HPLC-MS技術(shù)在氨基酸分析研究中得到更加廣泛的應(yīng)用。鄧其馨等[37]在HPLC-MS的基礎(chǔ)上，建立了快速測定煙草中18種游離氨基酸的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)，可用于煙草樣品中氨基酸的分析、檢測。黃翼飛等[38]建立同時對煙草中20 種游離氨基酸進行分析的LC-ESI-MS/MS法，并成功應(yīng)用于多種煙草樣品中氨基酸的分析測定。Le等[39]建立了同時測定33種氨基酸的HPLC-MS/MS方法，并將該方法與biochrom 30自動氨基酸分析儀法進行了比較。此外，HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)還可以進行手性氨基酸的分析研究[40]。隨著超高效液相色譜的興起，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在氨基酸分析中的快速定性、定量的優(yōu)勢凸顯，氨基酸分析的時間大大縮短，20種氨基酸在5 min內(nèi)得到定性、定量檢測，氨基酸的檢測效率得到明顯提高[41]。

5毛細管電泳法

毛細管電泳法是以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離技術(shù)，具有分離效率高、分析速度較快、應(yīng)用范圍廣泛、樣品用量小、儀器簡單、成本較低等優(yōu)點[42-43]。毛細管電泳法可用于食品、中草藥中氨基酸的分析檢測。陳冰等[44]利用高效毛細管電泳-間接紫外吸收檢測法在11min內(nèi)實現(xiàn)了鳥氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺的基線分離。丁娟娟等[45]利用毛細管電泳-激光誘導熒光對中藥制劑中氨基酸成分進行分析，各氨基酸在73.5～2 900.0 nmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)性，方法相對真實、可靠且便捷、快速。

6近紅外光譜法

近紅外光譜(Near Infrared,簡稱NIR)是近年發(fā)展迅速的一種快捷、簡便的分析方法，具有簡單、快速、無損、環(huán)保無污染以及同時測定等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、石油化工、制藥、食品等領(lǐng)域中[46-49]。NIR主要應(yīng)用于測定樣品中氨基酸的總量，可以通過建模來測定個別氨基酸的含量。

石巖等[50]利用近紅外技術(shù)檢測冬蟲夏草中氨基酸含量，分別建立3種氨基酸和總氨基酸含量測定模型，總氨基酸以及Asp、Glu、Arg含量測定模型相關(guān)系數(shù)結(jié)果相對準確且對樣本無損。Fontaine 等[51]將小麥、大麥、玉米等研磨、過篩后，采用近紅外光譜技術(shù)進行必需氨基酸的快速檢測和精準預測。結(jié)果表明，近紅外光譜技術(shù)可高效、準確地檢測出谷類中必需氨基酸的含量。結(jié)合不同的建模方式，可以利用NIR技術(shù)對樣品中的氨基酸總量進行無損、快速預測[52-53]。

7其他方法

7.1化學發(fā)光法(CL)該方法根據(jù)化學物質(zhì)由激發(fā)態(tài)回到低能級狀態(tài)過程中釋放光能的原理對物質(zhì)進行分析，且具有儀器設(shè)備簡單、操作方便、靈敏度高等優(yōu)點。它是一種實用的氨基酸檢測技術(shù)[54]。流動注射技術(shù)是CL法測定氨基酸的最重要的方法之一。郎惠云等[55]根據(jù)氨基酸在堿性條件下對次氯酸鈉-魯米諾化學發(fā)光體系有顯著增敏作用，建立了反相流動注射-化學發(fā)光法測定氨基酸的新方法。李莉等[56]發(fā)現(xiàn)高良姜素能使色氨酸在高錳酸鉀-多聚磷酸體系的化學發(fā)光強度大大增強，從而建立了測定色氨酸的流動注射-化學發(fā)光新方法。Lui等[57]利用魯米諾-H2O2-CuSO4化學發(fā)光體系建立快速檢測20種氨基酸的流動注射-化學發(fā)光法。

7.2熒光光譜法2002年郗娟等[58]依據(jù)氨基酸在醋酸-醋酸鈉緩沖介質(zhì)中能猝滅殼聚糖-茚三酮體系的原理，建立了檢測氨基酸的熒光光譜法。而后，基于在乙酸鹽緩沖介質(zhì)中氨基酸與乙酰丙酮及甲醛反應(yīng)產(chǎn)生黃綠色熒光，測定飲料、蜂蜜等食品中游離氨基酸含量[59-60]。

8結(jié)語

由于氨基酸在人體內(nèi)起重要作用，氨基酸分析已成為生命、食品、醫(yī)藥等研究領(lǐng)域以及常規(guī)的檢驗檢測工作中的重要技術(shù)，氨基酸分析方法的研究也越來越受關(guān)注。氨基酸的各種檢測方法各有優(yōu)缺點，其中高壓液相色譜法應(yīng)用最為廣泛。紫外檢測器成為高效液相色譜法測定氨基酸的傳統(tǒng)檢測器。這種方法屬于衍生間接測定法，其發(fā)展受到衍生劑和衍生方法的限制。為了克服衍生反應(yīng)的缺點，新型的氨基酸直接檢測技術(shù)將成為研究的熱點。IPAD技術(shù)和ELSD技術(shù)無需衍生化即直接檢測氨基酸，且方法簡單快捷，已成為氨基酸分析方法改進的新起點。此外，HPLC-MS集色譜的高分離能力和質(zhì)譜獨特的選擇性、靈敏度、相對分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)信息于一體，也可對未衍生化的氨基酸進行直接檢測，因此在氨基酸檢測領(lǐng)域應(yīng)用也起非常重要的作用。隨著色譜技術(shù)、檢測技術(shù)的不斷完善，超高壓液相色譜成為氨基酸分析的主流也是可以預見的。超快速、高靈敏、高準確的氨基酸分析技術(shù)將會不斷涌現(xiàn)，進而推動氨基酸的分析研究。

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摘要對分光光度法、氣相色譜法、液相色譜法、毛細管電泳法和近紅外光譜法等技術(shù)在氨基酸檢測中的應(yīng)用進行綜述，其中包括2種無需衍生的直接測定法——積分脈沖安培檢測法和蒸發(fā)光散射檢測法，并且比較衍生法中不同衍生劑的優(yōu)缺點。最后，展望氨基酸檢測方法的發(fā)展趨勢，為建立高效的氨基酸分析方法提供參考。

關(guān)鍵詞氨基酸；分光光度法；氣相色譜法；液相色譜法；毛細管電泳法；近紅外光譜法

Research Progress on the Detection Technology of Amino Acids

LIN Tai-feng1,2, ZHAO Meng-ke1, WANG Yan-ming1et al(1. College of Life Science and Bio-engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124; 2. Quality Supervision and Inspection Station of Beverages and Food Additives of Beijing, Beijing 100124)

AbstractThe application of these techniques, including spectrophotometry, gas chromatography, liquid chromatography, liquid chromatograph-mass spectrometer, capillary electrophoresis and near-infrared spectroscopy, is reviewed. Among them, integrated pulsed amperometric detection and evaporative light scattering detection, the two direct testing technologies for underivatized amino acids are also discussed. Besides, the advantages and disadvantages of different derivative agents are also compared. Finally, the development trend of detection technologies for amino acids is prospected to provide certain references for establishing a new high performance detection method of amino acids.

Key wordsAmino acid; Spectrophotometry; Gas chromatography; Liquid chromatography; Capillary electrophoresis; Near-infrared spectroscopy

收稿日期2015-05-05

作者簡介林太鳳(1978-)，男，江西贛州人，助理研究員，碩士，從事食品質(zhì)量與安全分析研究及快速檢測方法方面的研究。

基金項目2013年度北京工業(yè)大學教育教學研究項目(ER2013B22)。

中圖分類號S-03；TS 272.7

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2015)18-016-04