王斌++張騰霄++喬秀麗等

摘要：為尋求柴胡生產(chǎn)的最佳采收期，采用HPLC法、亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法研究不同采收期柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黃酮類物質(zhì)含量動態(tài)變化。結(jié)果表明，隨著采收期的延后，柴胡根中皂苷、黃酮類物質(zhì)含量都是先下降后上升再下降，且9月1日采收的柴胡中皂苷、黃酮含量都比較高。柴胡最佳采收期確定還應(yīng)結(jié)合其他主要有效成分含量動態(tài)積累的規(guī)律。該試驗方法簡便、快速、可靠。

關(guān)鍵詞：柴胡；皂苷；黃酮；采收期；動態(tài)積累

中圖分類號：R284.1文獻標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2015）11-0404-02

收稿日期：2014-11-01

基金項目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（編號：12543082）；黑龍江省綏化市科技計劃（編號：KJZD20120081）。

作者簡介：王斌（1980—），女，吉林敦化人，碩士，講師，主要從事天然藥物質(zhì)量評價研究、藥用蕈菌活性成分研究及藥學(xué)相關(guān)的教學(xué)與科研。E-mail：wangbinkuaike@163.com。柴胡是中國應(yīng)用廣泛的傳統(tǒng)中藥，2010版《中華人民共和國藥典》收錄的柴胡品種為柴胡（Bupleurum chinense DC）和狹葉柴胡（B.scorzonerifolium Willd）的干燥根，前者別稱北柴胡，后者別稱南柴胡。柴胡性味苦甘，入肝膽經(jīng)，具有和解退熱、升舉陽氣、疏肝解郁的功能。近代藥理研究表明，柴胡具有解熱、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)咳、抗炎、抗菌、抗病毒、保肝利膽、降血脂及抗消化道潰瘍等藥理活性[1]。柴胡中主要有效成分有皂苷、甾醇、揮發(fā)油、多糖等。目前，還發(fā)現(xiàn)柴胡中黃酮類成分具有利膽、抑菌、殺菌等作用。本試驗研究了不同采收期柴胡中皂苷、黃酮類成分含量動態(tài)積累，為尋求柴胡生產(chǎn)的最佳采收期及建立柴胡多指標(biāo)的質(zhì)量評價體系提供理論依據(jù)。

1材料于方法

1.1材料

試驗材料來源于黑龍江省明水縣春草園中藥材種植公司柴胡種植基地，2013年7月2日開始采樣，至10月6日結(jié)束，共分7期采樣，分別為：（1）7月2日；（2）7月17日；（3）8月3日；（4）8月15日；（5）9月1日；（6）9月17日；（7）10月6日。樣品為狹葉柴胡的根，采挖后立即洗去泥沙，通風(fēng)干燥，按采收時間對樣品編號。

1.2儀器

美國waters 2695 高效液相色譜儀系統(tǒng)；AB125-S 1/100 000的天平，瑞士梅特勒利多儀器（上海）有限公司；752紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；SB25-12DTD超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；分析天平FA2014，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；101-2A型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司；FW100高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3試劑

柴胡皂苷a對照品（中國食品藥品鑒定研究院，批號：10777-201108）、柴胡皂苷d對照品（中國食品藥品鑒定研究院，批號：10778-201208）蕓香苷對照品（中國食品藥品鑒定研究院，批號：100080-200707）、乙腈、水為色譜純，乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、蒸餾水，氨水、甲醇以上試劑均為分析純。

1.4分析與測定

1.4.1不同采收期柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的測定[2]

1.4.1.1對照品溶液的制備精確稱取柴胡皂苷a對照品10 mg、柴胡皂苷d對照品12 mg，加甲醇定容至25 mL容量瓶中，搖勻，即得。

1.4.1.2供試品溶液的制備取樣品粉末（過4號篩）約0.5 g，精確稱定，置具塞錐形瓶中，加入含5%濃氨試液的甲醇溶液25 mL，密塞，30 ℃超聲處理（功率200 W，頻率40 kHZ）30 min，濾過，用甲醇20 mL分2次洗滌容器及藥渣，洗液與濾液合并，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾（0.45 μm），棄初濾液，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.4.1.3色譜條件以十八烷基鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按表1中的規(guī)定進行梯度洗脫；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長為210 nm，理論半數(shù)按柴胡皂苷a峰計算應(yīng)不低于10 000。

表1流動相梯度洗脫

時間（min）流動相A（%）流動相B（%）0～5025→9075→1050～559010

1.4.1.4測定法分別精確吸取對照品溶液20 μL與供試品溶液20 μL，注入色譜儀，測定即得。

1.4.2不同采收期柴胡中黃酮類物質(zhì)的測定

1.4.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（1）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。干燥恒質(zhì)量的蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，加60%乙醇20 mL于水浴60 ℃溶解，配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。（2）線性關(guān)系考察。精確吸取0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液至25mL容量瓶中，加入0.7 mL 5%NaNO2，5 min后再加入0.7mL 10%Al（NO3）3，放置10 min，加入5.0 mL 4%NaOH，混勻后用30%乙醇定容至刻度，于38 ℃水浴中顯色15 min，以試劑空白對照，在510 nm處測定吸光度。以蕓香苷質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度（D）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2.2樣品的測定（1）樣品溶液的制備。將樣品于 60 ℃真空干燥5 h，于粉碎機中粉碎，過40目篩，貯存于具塞錐形瓶中，置干燥器中備用。稱取粉碎的樣品粉末2.0 g，置于100 mL 錐形瓶中加入70%乙醇30 mL，用封口膜密封，浸泡12 h，超聲提取，提取溫度60 ℃，提取時間15 min，超聲功率60%，提取完畢，真空過濾，取上清液。第2次提取加入70%乙醇15 mL，其他提取條件不變，合并2次的提取上清液，用70%乙醇定容至35 mL，備用。（2）樣品的測定與結(jié)果。精確吸取樣品溶液5 mL，在“1.4.1.4”節(jié)條件下測定樣品，每個測試樣品溶液平行3次測定，取平均值代入公式計算黃酮類物質(zhì)含量。

黃酮類物質(zhì)含量=X×7÷1 000÷m×100%。

式中：X為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算換算為蕓香苷的質(zhì)量，mg；m為制備樣品測定液時稱取的柴胡干燥粉末的質(zhì)量，g。

1.5方法學(xué)考察

1.5.1精密度試驗精確稱取樣品，分別按“1.4.1.2”和“1.4.1.4”節(jié)下的條件制備供試品溶液，按樣品測定項操作連續(xù)記錄色譜圖5次，計算主要峰的峰面積。精密稱取樣品，分別按“1.4.2.1”和“1.4.2.2”節(jié)下的條件制備供試品溶液，按樣品測定項操作連續(xù)測吸光度各5次，計算黃酮類物質(zhì)含量。

1.5.2加樣回收率試驗以重復(fù)試驗所得的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黃酮平均含量為樣品含量，精確稱取樣品5份，加入等量對照品溶液，按樣品測定項操作。

1.5.3重復(fù)性試驗精確稱取樣品，分別按“1.4.1.2”、“1.4.1.4”、“1.4.2.1”、“1.4.2.2”節(jié)下的條件制備供試品溶液各5份，記錄色譜圖，計算主要峰的峰面積、測定吸光度。

1.5.4穩(wěn)定性試驗精確稱取樣品，分別按“1.4.1.2”、“1.4.1.4”、“1.4.2.1”、“1.4.2.2”節(jié)下的條件制備供試品溶液，分別于0、1、2、4、 8 h 進樣，記錄色譜圖，計算主要峰的峰面積、測定吸光度。

2結(jié)果與分析

2.1精密度及加樣回收率

精密度及加樣回收率試驗結(jié)果表明，精密度良好，RSD分別為1.03%、1.89%，加樣回收率為99.91 %、100.35%。表明HPLC法測定柴胡中的皂苷、亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定柴胡中的黃酮類物質(zhì)含量方法簡便、可靠、易行。

2.2重復(fù)性及穩(wěn)定性

重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，重復(fù)性良好，RSD分別為0.95%、1.14%。穩(wěn)定性試驗測試結(jié)果表明，在8 h內(nèi)色譜圖、吸光度均基本穩(wěn)定。表明該測定方法重復(fù)性好且測定的數(shù)據(jù)穩(wěn)定。

2.3不同采收期柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量

通過計算，不同采收期柴胡中黃酮類物質(zhì)的含量不同，隨著采收期的延后，根中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、柴胡皂苷a+d含量的變化趨勢都是先下降后上升再下降。其中8月3日采收樣品皂苷含量最低，柴胡皂苷a、d含量分別為0.047%、0.050%，9月1日采收的樣品皂苷含量最高，柴胡皂苷a、d含量分別為0.203%、0.207%。

2.4不同采收期柴胡中黃酮類物質(zhì)的含量

不同采收期柴胡中黃酮類物質(zhì)的含量不同，隨著采收期的延后，根中黃酮類物質(zhì)含量的變化趨勢是先下降后上升再下降。其中，8月15日采收的樣品黃酮類物質(zhì)含量比較低，為0.291%，9月1日、9月17日采收的樣品黃酮類物質(zhì)含量比較高，分別為0.416%、0.440%（圖3）。經(jīng)回歸分析得出柴胡黃酮類物質(zhì)含量的回歸方程為：y=0.379 8x+0.041 5，r=0.994 8，表明蕓香苷在0.8～2.0 mg 呈良好的線性關(guān)系。

3結(jié)論與討論

應(yīng)用HPLC法、亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定不同采收期柴胡根中柴胡皂苷、黃酮類物質(zhì)含量，并對測定方法進行了全面的

方法學(xué)考察，其中回收率試驗和精密度試驗結(jié)果表明，該方法排除了干擾因素，精密度良好，說明該方法簡便、可靠、易行。

采收期是藥材生產(chǎn)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，直接影響藥材的品質(zhì)。藥材有效成分的積累具有一定的規(guī)律，按照有效成分積累規(guī)律進行采收可以保障藥材的質(zhì)量，反之則會導(dǎo)致藥材質(zhì)量下降。在本研究中，隨著采收期的延后，根中柴胡皂苷、黃酮類物質(zhì)含量都是先下降后上升再下降。9月1日采收的柴胡皂苷、黃酮類物質(zhì)含量比較高。原因是隨著柴胡地上部分的發(fā)育，根中柴胡皂苷、黃酮類物質(zhì)含量呈下降趨勢，至9月地上部分基本停止生長，其體內(nèi)的代謝物質(zhì)向根內(nèi)轉(zhuǎn)移，大部分皂苷、黃酮類物質(zhì)含量又開始升高。王斌等對不同采收期柴胡糖類物質(zhì)含量動態(tài)積累規(guī)律進行研究，結(jié)果表明，隨著采收期的延后，柴胡中總糖、多糖含量呈現(xiàn)先下降后上升再下降再上升的變化趨勢[3]。7月15日、10月2日采收的總多糖含量有2個高峰期。因此，柴胡最佳采收期還應(yīng)結(jié)合糖類物質(zhì)及其他主要有效成分含量動態(tài)積累的規(guī)律及藥材有效成分總產(chǎn)量來確定。

本研究首次同時以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黃酮類物質(zhì)含量來探討柴胡中有效成分積累規(guī)律，為柴胡多指標(biāo)質(zhì)量評價體系的建立提供了理論依據(jù)。

參考文獻：

[1]王斌，張騰霄，馬松艷，等. 柴胡的臨床應(yīng)用及配伍規(guī)律研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2012，23（1）：225-227.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：263.

[3]王斌，張騰霄，劉利軍. 不同采收期對柴胡糖類物質(zhì)動態(tài)積累的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（6）：76-78.徐燕，邱詩春. 大豆中硒的示波極譜法測定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11：406-407.