楊紅++張勇++田啟培等

摘要：以高腳雞、矮腳雞和百宜黑雞為研究對(duì)象，構(gòu)建品種DNA池，PCR擴(kuò)增生長(zhǎng)激素（GH）基因所有外顯子和部分內(nèi)含子序列，采用直接測(cè)序法對(duì)3個(gè)雞種的GH基因進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)不同多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)GH基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，旨在通過對(duì)貴州脛長(zhǎng)差異較大的高腳雞、矮腳雞和百宜黑雞GH基因的多態(tài)性及其生物信息學(xué)進(jìn)行分析，研究GH基因?qū)Σ煌u種脛骨發(fā)育的影響。結(jié)果表明：在高腳雞、矮腳雞和百宜黑雞3個(gè)雞種GH基因中共檢測(cè)到8個(gè)SNPs位點(diǎn)，其中A1133G、G1166A位于第2內(nèi)含子區(qū)，C2027G、C2030T位于第4外顯子區(qū)，G2152A位于第4內(nèi)含子區(qū)，G3347A位于第5外顯子區(qū)，T3416C和C3436T位于3′非編碼區(qū)。生物信息學(xué)分析顯示位于外顯子區(qū)的3個(gè)SNPs均為同義突變，對(duì)GH基因的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)有一定影響。

關(guān)鍵詞：DNA池；GH基因；脛骨長(zhǎng)度；SNPs；高腳雞；矮腳雞；百宜黑雞

中圖分類號(hào)：S831.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0038-04

收稿日期：2014-11-03

基金項(xiàng)目：貴州省科技計(jì)劃（編號(hào)：黔合科NZ字[2012]3007號(hào)）；貴州省農(nóng)業(yè)動(dòng)植物育種專項(xiàng)（編號(hào)：黔農(nóng)育專字[2012]10號(hào)）；浙江大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（編號(hào)：2012XZZX003-1）。

作者簡(jiǎn)介：楊紅（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與種質(zhì)資源創(chuàng)新。Email：15085933126@139.com。

通信作者：王芳芳，女，高級(jí)畜牧師，主要從事家禽遺傳育種及飼養(yǎng)管理工作。E-mail：1587676665@qq.com。貴州省地形復(fù)雜、地貌特殊，具有豐富的地方雞種資源，其中包括竹鄉(xiāng)雞、威寧雞、黔東南小香雞、高腳雞、矮腳雞、百宜黑雞等。高腳雞、矮腳雞、百宜黑雞均為貴州省特有的地方雞種，在體型外貌尤其是脛骨長(zhǎng)度上存在較大差異。高腳雞是貴州省特有的地方品種，1982年錄入《貴州省畜禽品種志》，2006年錄入《中國(guó)畜禽資源名錄》，其脛骨比其他品種雞長(zhǎng)3～4 cm，公雞平均脛長(zhǎng)13.62 cm、母雞平均脛長(zhǎng) 10.92 cm[1]。矮腳雞分布于貴州省黔西南州興義市，其脛長(zhǎng)較普通雞短，公雞平均脛長(zhǎng)6.5 cm、母雞平均脛長(zhǎng)5.9 cm[2]，1993年錄入《貴州省畜禽品種志》。百宜黑雞為貴州優(yōu)質(zhì)地方雞種，主產(chǎn)地為貴陽市烏當(dāng)區(qū)百宜鄉(xiāng)[3]，其脛骨長(zhǎng)度介于高腳雞和矮腳之間。

雞生長(zhǎng)激素（chiken growth hormone，cGH）是由垂體前葉合成和分泌的一種多肽類激素，由191個(gè)氨基酸組成。研究報(bào)道稱該激素在雞生長(zhǎng)發(fā)育、骨骼生長(zhǎng)、脂肪沉積、飼料轉(zhuǎn)化及產(chǎn)蛋等方面具有調(diào)節(jié)作用[4]。該基因位于1號(hào)染色體，全長(zhǎng)近4 kb，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成，且內(nèi)含子遠(yuǎn)大于外顯子[5-6]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼發(fā)現(xiàn)GH基因的多態(tài)位點(diǎn)對(duì)雞各類生長(zhǎng)性狀有特定影響[7-10]。對(duì)于貴州省境內(nèi)部分雞種的GH基因已有相關(guān)研究，如朱麗莉等對(duì)興義矮腳雞GH基因的多態(tài)性研究中發(fā)現(xiàn)該雞種在第一內(nèi)含子區(qū)域存在較多變異[11]。黃波等在對(duì)貴州小香雞GH基因研究中，對(duì)GH基因2～3外顯子區(qū)域SNP位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)并開展了相關(guān)性分析[12]。本試驗(yàn)選擇脛骨長(zhǎng)度差異較大的高腳雞、矮腳雞、百宜黑雞作為對(duì)象，研究GH基因的多態(tài)性，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在檢測(cè)GH基因在不同脛長(zhǎng)性狀雞種中的差異，以期探究GH基因多態(tài)性與脛骨生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系，為進(jìn)一步研究影響脛骨發(fā)育機(jī)制的功能基因奠定工作基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物高腳雞92個(gè)血樣采自貴州省安順市普定縣，矮腳雞99個(gè)血樣采自貴州省黔西南州興義市興牧畜禽水產(chǎn)科技服務(wù)中心矮腳雞養(yǎng)殖場(chǎng)，百宜黑雞69個(gè)血樣采自其中心產(chǎn)區(qū)貴州省貴陽市百宜鄉(xiāng)。每羽雞翅下靜脈采血2～3 mL于真空采血管中，肝素鈉抗凝，-20 ℃保存。

1.1.2主要試劑血液基因組DNA提取試劑盒、2×Taq Master Mix、核酸染料、DL2000 DNA Marker 等試劑均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。實(shí)驗(yàn)室自備試劑為去離子水、無水乙醇、TAE緩沖液等。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取、檢測(cè)及構(gòu)建DNA池運(yùn)用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA，用含核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度，凝膠成像系統(tǒng)照相保存，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA樣品濃度，每個(gè)樣品測(cè)量3次，取平均值。用ddH2O將所有DNA樣品調(diào)至100 ng/μL，各取10 μL構(gòu)建品種DNA池[13]，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增參照GenBank（登錄號(hào)為 NC_006114.3）提供的雞GH基因序列，運(yùn)用 Primer Premier 6.0 和 Oligo 6.0 設(shè)計(jì)引物，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列及擴(kuò)增條件如表1。

2結(jié)果與分析

2.1DNA提取結(jié)果

將提取的DNA用含核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖1。由圖1可見，DNA條帶集中，整齊明亮無拖尾，可用于下一步試驗(yàn)。

2.2PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

PCR產(chǎn)物用含核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖2：所檢測(cè)片段與預(yù)期片段大小相符，條帶清晰、整齊無拖尾，PCR產(chǎn)物特異性較好，可用于進(jìn)一步測(cè)序分析。

2.3序列分析

在所擴(kuò)增的序列中共發(fā)現(xiàn)6個(gè)SNPs 位點(diǎn)：第2內(nèi)含子A1133G、G1166A，第4外顯子C2027G、C2030T，第4內(nèi)含子G2152A，第5外顯子G3347A，3′非編碼區(qū)T3416C、 C3436T（圖3）。

2.4等位基因頻率估算

從表2可見，3個(gè)雞種在A1133G、G1166A、C2027G、G2152A、C3436T這5個(gè)SNPs位點(diǎn)上基因頻率存在較大差異。

2.5GH基因所有外顯子RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

采用在線軟件 RNAfold web server分別對(duì)在GH基因外顯子中的3個(gè) SNPs 位點(diǎn) mRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見圖4。

3討論

雞脛骨為全身長(zhǎng)骨之一，其生長(zhǎng)過程受到多種激素及細(xì)胞因子調(diào)控，且存在不同的信號(hào)通路。GH基因是調(diào)控禽類整個(gè)機(jī)體的重要激素，具有加快肌肉和骨骼生長(zhǎng)、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育及提高飼料報(bào)酬的作用[15-17]，也有研究報(bào)道稱GH基因可促進(jìn)雞長(zhǎng)骨和軟骨的發(fā)育[18]。朱麗莉等對(duì)貴州個(gè)體較小的矮腳雞、小香雞的GH基因進(jìn)行了多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)較多變異位點(diǎn)，通過關(guān)聯(lián)性分析得到該基因?qū)w斜長(zhǎng)、脛長(zhǎng)、脛圍等生長(zhǎng)性狀有一定的影響[11-12]。

本研究對(duì)脛長(zhǎng)差異較大的高腳雞、矮腳雞和百宜黑雞的GH基因所有外顯子和部分內(nèi)含子進(jìn)行了單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了8個(gè)可能與脛長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNPs位點(diǎn)，分別為A1133G、G1166A、C2027G、C2030T、G2152A、G3347A、T3416C、C3436T。其中C2027G、C2030T等2個(gè)SNPs位點(diǎn)位于第4外顯子區(qū)，G3347A位于第5外顯子區(qū)，3個(gè)位于外顯子區(qū)域的SNP位點(diǎn)均為同義突變。

各SNPs位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，在第2內(nèi)含子區(qū)A1133G處，只有高腳雞發(fā)生了突變，矮腳雞與百宜黑雞均未發(fā)生突變；第4內(nèi)含子G2152A處，高腳雞的優(yōu)勢(shì)堿基為G，矮腳雞與百宜黑雞的優(yōu)勢(shì)堿基則為A；3′非編碼區(qū)C3436T處，高腳雞未發(fā)現(xiàn)SNPs位點(diǎn)，而矮腳雞、百宜黑雞卻存在突變。這表明高腳雞在A1133G、G2152A、C3436T這3個(gè)SNPs位點(diǎn)上與其他2個(gè)雞種存在較大差異，推測(cè)這2個(gè)SNPs位點(diǎn)可能對(duì)高腳雞脛骨長(zhǎng)度有較大影響。在G1166A、C2027G位點(diǎn)處，矮腳雞發(fā)生突變的基因頻率與高腳雞和百宜黑雞差異較大，推測(cè)這2個(gè)SNPs位點(diǎn)可能與矮腳雞脛骨較短存在相關(guān)性。同時(shí)，在C2027G位點(diǎn)處，這3個(gè)貴州地方雞種的優(yōu)勢(shì)堿基均為G，而GenBank（登錄號(hào)為NC_006114.3）中所報(bào)道的則為C，這可能是貴州地方雞種的一個(gè)共同特征，同時(shí)也是貴州地方雞種與其他雞種之間所存在的普遍差異。

真核生物的基因一般由若干個(gè)外顯子和內(nèi)含子組成，為斷裂基因，外顯子的功能是構(gòu)成編碼區(qū)編碼功能蛋白，編碼區(qū)內(nèi)核苷酸的變異可能導(dǎo)致基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而影響其生物功能[15]。本研究中所檢測(cè)出的3個(gè)SNPs位點(diǎn)均未引起所編碼氨基酸改變，為同義突變。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，所檢測(cè)到的3個(gè)SNPs位點(diǎn)均導(dǎo)致了GH基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，使其最小自由能發(fā)生變化，從而影響mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。當(dāng)C2027G發(fā)生C→G突變后，GH基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最小自由能增加了167.894 kJ/mol，其穩(wěn)定性減弱；當(dāng)C2030T發(fā)生C→T突變后，GH基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最小自由能減少了2.51 kJ/mol，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增加；當(dāng)G3347A發(fā)生G→T突變后，GH基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最小自由能增加了7.093 kJ/mol，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性減弱。GH基因突變與雞脛骨長(zhǎng)度的關(guān)系及其引起的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)變化所發(fā)生的生物學(xué)意義將在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)一步加以研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]金睿，葉方，朱明貴. 普定高腳雞資源現(xiàn)狀分析[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011（10）：331，337.

[2]張福平，華時(shí)尚，傅筑蔭，等. 興義矮腳雞矮腳性狀初步研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（2）：316-317.

[3]張小林，陽光遠(yuǎn). 百宜黑羽雞的種質(zhì)特性研究初探[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（4）：131-134.

[4]顏炳學(xué)，鄧學(xué)梅，費(fèi)菁，等. 雞生長(zhǎng)激素基因單核苷酸多態(tài)與生長(zhǎng)及屠體性狀的相關(guān)性[J]. 科學(xué)通報(bào)，2003，48（12）：1304-1307.

[5]Tanaka M，Hosokawa Y，Watahiki M，et al. Structure of the chicken growth hormone-encoding gene and its promoter region[J]. Gene，1992，112（2）：235-239.

[6]Shaw E M，Shoffner R N，F(xiàn)oster D N，et al. Mapping of the growth hormone gene by in situ hybridization to chicken chromosome 1[J]. Journal of Heredity，1992，82（6）：505-508.

[7]Fotouhi N，Karatzas C N，Kuhnlein U，et al. Identification of growth hormone DNA polymorphisms which respond to divergent selection for abdominal fat content in chickens[J]. Theoretical and Applied Genetics，1993，85（8）：931-936.

[8]聶慶華，張細(xì)權(quán)，楊關(guān)福，等. 雞生長(zhǎng)激素基因的PCR-RFLPs分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2001，9（3）：282-285.

[9]Kuhnlein U，Ni L，Weigend S，et al. DNA polymorphisms in the chicken growth hormone gene：response to selection for disease resistance and association with egg production[J]. Animal Genetics，1997，28（2）：116-123.

[10]王麗華，段修軍，董飚，等. 黑羽番鴨GH基因多態(tài)性與體質(zhì)量、屠宰性能的相關(guān)性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：30-33.

[11]朱麗莉，王闖，傅筑蔭，等. 興義矮腳雞GH基因的多態(tài)性研究[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010，37（12）：96-99.

[12]黃波，劉若余，艾蓉，等. 貴州小香雞GH基因SNP與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性分析[J]. 中國(guó)家禽，2012，34（3）：30-33.

[13]李敬瑞，丁遠(yuǎn)華，向程舉，等. 豬DAZ基因的DNA池測(cè)序分析[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011，38（8）：60-62.

[14]崔建勛，杜紅麗，張細(xì)權(quán). 利用DNA池和測(cè)序技術(shù)快速篩查SNPs及估算基因頻率[J]. 遺傳學(xué)報(bào)，2005，32（4）：372-377.

[15]聶慶華，張細(xì)權(quán)，楊關(guān)福. 雞生長(zhǎng)軸相關(guān)基因的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2003，11（3）：305-312.

[16]Rosselot G，Mcmurtry J P，Vasilatos-Younken R，et al. Effect of exogenous chicken growth hormone （cGH） administration on insulin-like growth factor-Ⅰ （IGF-Ⅰ） gene expression in domestic fowl[J]. Molecular and Cellular Endocrinology，1995，114（1/2）：157-166.

[17]裴勤嫻. 雞GH基因和GHR基因多態(tài)性與早期生長(zhǎng)性能的相關(guān)性研究[D]. 貴陽：貴州大學(xué)，2007.

[18]高愛琴，李金泉，李寧，等. 綿羊FGF5基因SNP的生物信息學(xué)分析[J]. 中國(guó)畜牧雜志，2008，44（5）：5-7.劉青，李朝煒，朱昀，等. 抗逆轉(zhuǎn)基因旱稻轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11）：42-45.