李英夫，李明軍，廉曉宇，宣兆博

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科,黑龍江 佳木斯 154003)

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欖香烯和VEGF多克隆抗體聯(lián)合應(yīng)用對大鼠腦膠質(zhì)瘤增殖的影響①

李英夫，李明軍，廉曉宇，宣兆博

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科,黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的:對Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤增殖中應(yīng)用VEGF多克隆抗體與欖香烯聯(lián)合應(yīng)用的抑制效果進行分析與探討。方法：構(gòu)建Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤模型，此模型為腦膠質(zhì)瘤模型，膠質(zhì)瘤細(xì)胞為SHG-44，大鼠接種成瘤后將其隨機分為4組，每組大鼠8只，A組大鼠給予生理鹽水，B組大鼠給予欖香烯，C組大鼠給予VEGF多克隆抗體，D組大鼠給予VEGF多克隆抗體與欖香烯。鏡下對腫瘤組織病理切片進行觀察。結(jié)果：研究組腫瘤標(biāo)本壞死灶較多，腫瘤細(xì)胞中含有大量核破裂，而對照組腫瘤標(biāo)本具有較多血管數(shù)量，血管管壁增厚，腫瘤血管減少量與組織壞死程度D組明顯多于B組與C組。結(jié)論：研究表明，VEGF多克隆抗體與欖香烯聯(lián)合使用對腫瘤組織生長具有有效抑制作用，具有協(xié)同作用，VEGF多克隆抗體與欖香烯對細(xì)胞凋亡具有促進作用，兩者聯(lián)合使用存在協(xié)同效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：VEGF多克隆抗體；欖香烯；Wistar膠質(zhì)瘤模型

本研究為對Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤增殖中應(yīng)用VEGF多克隆抗體與欖香烯聯(lián)合應(yīng)用的抑制效果進行分析與探討，構(gòu)建Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤模型，具體報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

由吉林醫(yī)學(xué)院生化研究機構(gòu)提供膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，并從佳木斯大學(xué)動物實驗中心購置Wistar大鼠，選用美國BD公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀，日本CK公司生產(chǎn)的倒置顯微鏡，L eica CM1100切片機。

1.2方法

1.2.1動物接種與分組

通過酒精與強力碘為大鼠背部進行消毒，6號針頭注射器將1mL大鼠細(xì)胞懸液抽取出來，接種在大鼠腦部尾狀核，并于每2d對腫瘤生長情況進行觀察，5d左右即可觸及皮下腫瘤，14d皮下腫瘤直徑就可達15mm，把呈橢圓形或者圓形，直徑大約15mm生長合格的腫瘤當(dāng)作試驗?zāi)[瘤模型，隨機分為4組，每組有大鼠8只，將其分開飼養(yǎng)，且命名為A、B、C、D組，A組(對照組)大鼠給予生理鹽水，B組(研究組)大鼠給予欖香烯，C組(研究組)大鼠給予VEGF多克隆抗體，D(研究組)組大鼠給予VEGF多克隆抗體與欖香烯。

1.2.2懸液制備與細(xì)胞培養(yǎng)

SHG-44來源于人額葉星形膠質(zhì)瘤的穩(wěn)定培養(yǎng)，具有特異性標(biāo)志膠質(zhì)酸性纖維蛋白(GFAP)，SHG-44是目前較理想的細(xì)胞株，能夠穩(wěn)定的培養(yǎng)，并在Wistar大鼠尾狀核區(qū)成功植入，將復(fù)蘇成功的SHG-44細(xì)胞株，放于50cm2培養(yǎng)瓶中接種，DMEM培養(yǎng)基中含有10%滅活的胎牛血清，還含有鏈霉素100mg/mL、青霉素100U/mL、NaHCO33.7g/L，培養(yǎng)瓶置于5%CO2的培養(yǎng)箱中，溫度恒定于37℃，SHG-44細(xì)胞滿瓶后,將培養(yǎng)液傾倒出去,0.25%胰酶消化培養(yǎng)瓶中的SHG-44細(xì)胞,顯微鏡下觀察SHG-44細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞開始皺縮時,加入營養(yǎng)液,并反復(fù)吹打，使SHG-44細(xì)胞脫壁,并用離心機離心5min，離心轉(zhuǎn)數(shù)為1000r/min，將上清液棄出，制成106細(xì)胞/瓶的細(xì)胞懸液,接種于25cm2培養(yǎng)瓶中[1]。

1.2.3動物模型制作前準(zhǔn)備

全實驗過程每周兩次注射地塞米松，0.15mg腹腔內(nèi)注射，接種前3d，每日給予地塞米松，劑量為100g體重1mg，給藥方式為灌胃，降低排斥反應(yīng)，用10%水合氯醛麻醉，給藥劑量為每10g體重0.4mL，剪去穿刺點周圍毛，面積約1.0cm×1.5cm。

1.2.4模型制作

植入靶點為右側(cè)尾狀核區(qū)，穿刺點為矢狀縫右旁開3.5mm和前囟中點前1.0mm，麻醉滿意后，將Wistar大鼠固定于立體定向儀上，剪去穿刺點周圍毛,高效碘消毒,鋪無菌洞巾，切開內(nèi)眥連線與正中矢狀面交點向后1mm，定位預(yù)先穿刺點，牙科鉆顱骨鉆孔，直徑1.2mm，用1mm微量注射器針頭刺破硬膜，向下垂直進入硬膜下6mm, 再后撤1mm，將細(xì)胞懸液1×106/20μL，以每分鐘1μL的速度緩慢注入右側(cè)尾狀核區(qū)，穿刺針停留5min，骨蠟封閉骨孔，縫合頭皮[1]。

1.2.5給藥方法

VEGF多克隆抗體給藥量為50 只，欖香烯為20mg/kg,根據(jù)1mg:1000mL的比例對VEGF多克隆抗體進行稀釋， 1%欖香烯劑型是20mL中含20mg，通過生理鹽水將欖香烯配置為100mL中含100mg，大鼠腹腔隔日給予VEGF多克隆抗體與欖香烯。

1.3腫瘤病理學(xué)觀察

10%中性甲醛固定腫瘤組織，石蠟包埋，5μm層厚切片，HE常規(guī)染色，并于光鏡下對組織切片進行分析。7d時進行頭部MRI檢查，將成瘤的大鼠作為實驗對象，分別于接種后的7、14、21d、自然死亡的幾個時間點觀察大鼠的生存狀態(tài)，包括如下幾個方面：飲食情況；肢體是否有活動障礙；顱神經(jīng)是否有功能確實；以及視覺反應(yīng)；全身抽搐和持續(xù)時間等。21d處死大鼠和死亡的大鼠進行HE染色，光鏡下觀察。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，兩組采用Q檢驗，方差分析多組，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1腫瘤病理學(xué)觀察

在光鏡下對Wistar大鼠膠質(zhì)瘤標(biāo)本進行觀察發(fā)現(xiàn)呈小梭形，具有較大細(xì)胞核，呈異形，易發(fā)現(xiàn)核分裂相，染色質(zhì)豐富，很少有細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞略微突起，研究組腫瘤標(biāo)本壞死灶較多，腫瘤細(xì)胞中含有大量核破裂，腫瘤血管減少量與組織壞死程度D組明顯多于B組與C組。

2.2各組影響腫瘤細(xì)胞凋亡機制

A、B、C、D組細(xì)胞凋亡率分別是(0.47±0.18)%、(13.0±1.60)%、(11.8±1.60)%、(19.5±1.31)%，組件腫瘤細(xì)胞凋亡率相比，差異性比較明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1　各組標(biāo)本腫瘤細(xì)胞凋亡率

3　討論

臨床中，神經(jīng)質(zhì)瘤具有較高的發(fā)病率，而且是一種比較常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，其所占比例大約為37.5%~60.5%，目前在治療該方面的進展也比較慢，現(xiàn)階段常規(guī)治療膠質(zhì)瘤主要是手術(shù)治療，術(shù)后再行化療與放療。近年來，闡明腫瘤血管病理生理后，為治療腫瘤開辟更多新途徑。VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)對血管發(fā)生與形成具有調(diào)節(jié)作用，在形成腫瘤過程中具有關(guān)鍵作用[3]。而且VEGF抗體可結(jié)合循環(huán)VEGF，是VEGF蛋白構(gòu)向得以轉(zhuǎn)變，有效遏制VEGFR和VEGF結(jié)合位點，避免VEGF結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR，對VEGF信號通路具有阻斷作用，有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移與增殖，而且對血管形成也具有抑制性作用[4]。欖香烯提取物為姜科植物溫郁金，其主要成分為β-欖香烯，屬于萜烯類化合物，且含少量γ與α欖香烯，相關(guān)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，欖香烯能夠有效殺傷與抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞。臨床研究顯示，在多種腫瘤中，欖香烯療效確切，而且能夠有效對抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤。本研究結(jié)果顯示，研究組腫瘤標(biāo)本壞死灶較多，腫瘤細(xì)胞中含有大量核破裂，而對照組腫瘤標(biāo)本具有較多血管數(shù)量，血管管壁增厚，腫瘤血管減少量與組織壞死程度D組明顯多于B組與C組。研究表明，VEGF多克隆抗體與欖香烯聯(lián)合使用對腫瘤組織生長具有有效抑制作用，具有協(xié)同作用，VEGF多克隆抗體與欖香烯對細(xì)胞凋亡具有促進作用，兩者聯(lián)合使用存在協(xié)同效應(yīng)。

參考文獻：

[1]關(guān)曉燕. 欖香烯對人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株體外放射增敏機制研究[J].中南大學(xué)，2012:123-124

[2]李英夫，李明軍. Wistar 大鼠SHG - 44 腦膠質(zhì)瘤動物模型建立[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2015，38(2)：24-25

[3]許浪,劉丹.欖香烯誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡作用的劑量和時間依賴性研究[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2009,(6):108-109

[4]廉曉宇，李顯偉.欖香烯和VEGF多克隆抗體聯(lián)合應(yīng)用對C6膠質(zhì)瘤增殖抑制作用的研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2009，32(1)：14-15

中圖分類號:R742

文獻標(biāo)識碼：B

文章編號：1008-0104(2015)06-0099-02

作者簡介：①李英夫(1979～)男，黑龍江明水人，碩士，主治醫(yī)師。

通訊作者：李明軍(1965～)男，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，主任醫(yī)師。E-mail:liyingfu79@sohu.com。

(收稿日期：2015-07-03)