王星權(quán)，王亞洲，陳玉強(qiáng)，王躍生，呂　鑫

(佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154003)

?

Smad-4在結(jié)直腸癌的表達(dá)及評(píng)價(jià)患者預(yù)后的研究①

王星權(quán)，王亞洲，陳玉強(qiáng)，王躍生，呂鑫

(佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的: 借助免疫組化方法檢測(cè)結(jié)直腸癌及癌旁組織中Smad-4的表達(dá)情況，評(píng)估Smad-4作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后評(píng)估指標(biāo)的可能性。方法:采用免疫組化法檢測(cè)97例結(jié)直腸癌組織及37例癌旁組織中Smad-4的表達(dá)情況，結(jié)合患者的臨床隨訪資料數(shù)據(jù)回顧性分析患者腫瘤標(biāo)本中Smad-4的表達(dá)量與患者術(shù)后總體無瘤生存兩者之間的關(guān)系。結(jié)果:一定比例的(63例)結(jié)直腸癌腫瘤組織中可見Smad-4蛋白的顯著表達(dá)，其陽性表達(dá)率為64.94% [63/97]，高于癌旁、正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞，在結(jié)直腸癌旁組織中的陽性表達(dá)率為(6例)16.21%[6/37]，兩者比較，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而且證實(shí)Smad-4蛋白表達(dá)高、低兩組患者的術(shù)后生存情況有顯著差異(P<0.05)。結(jié)論：Smad-4蛋白在結(jié)直腸癌患者組織中存在高表達(dá)，在患者腫瘤組織中存在Smad-4高表和低表達(dá)的兩類患者中，其臨床預(yù)后存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Smad-4蛋白可以有條件的作為評(píng)估術(shù)后結(jié)直腸癌患者臨床預(yù)后的蛋白標(biāo)記物。

關(guān)鍵詞：Smad-4；結(jié)腸癌；免疫組化

近些年來，結(jié)直腸癌在我國(guó)的發(fā)病率逐年增高，結(jié)直腸癌一直是我國(guó)消化系腫瘤研究領(lǐng)域的重點(diǎn)關(guān)注項(xiàng)目，是最常見的惡性腫瘤之一[1]。2008年，全球有超過120萬的結(jié)直腸癌新發(fā)病例，其死亡率約占全部惡性腫瘤的8%[2]其是發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤,其浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移程度是影響預(yù)后的主要因素[3]。Smad-4蛋白的基因定位于常染色體18q21，其所編碼的Smad-4蛋白是TGF-β1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮功能時(shí)所涉及的必須的介導(dǎo)分子蛋白，對(duì)維持機(jī)體細(xì)胞正常的生長(zhǎng)、發(fā)育起著重要的作用，兩者數(shù)量、結(jié)構(gòu)、功能上的穩(wěn)定性是TGF-β1 在細(xì)胞內(nèi)外不同環(huán)境下發(fā)揮多種生理、病理功能并產(chǎn)生各種生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵，這其中涉及到腫瘤的發(fā)生、發(fā)展病理生理過程[4]。多項(xiàng)研究均證實(shí)Smad蛋白家族和腫瘤的關(guān)系十分密切，在很多實(shí)體瘤和非實(shí)體腫瘤中都有明確表達(dá)和病理學(xué)意義[5,6]。 本課題擬通過考察Smad-4在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況同時(shí)整合結(jié)直腸癌患者的術(shù)后隨訪資料，同時(shí)考查其在評(píng)價(jià)結(jié)直腸癌患者臨床預(yù)后方面的意義以及將Smad-4作為評(píng)價(jià)結(jié)直腸癌患者預(yù)后參考指標(biāo)的可能性，從而對(duì)臨床結(jié)直腸癌患者術(shù)后的生存預(yù)測(cè)、指導(dǎo)患者綜合治療方案的實(shí)施有意義。

1　材料和方法

1.1標(biāo)本來源與分組

實(shí)驗(yàn)組：結(jié)直腸癌標(biāo)本組織來源及病例選擇、納入標(biāo)準(zhǔn)選取2006-02～2008-12佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院結(jié)直腸癌根治術(shù)的患者病理標(biāo)本。研究期間共查找到164例病歷資料或記錄明確因結(jié)直腸癌而在我院行結(jié)直腸癌根治術(shù)治療的患者，根據(jù)納入研究標(biāo)準(zhǔn)篩選接受結(jié)直腸癌根治術(shù)且已經(jīng)獲取確切隨訪資料的結(jié)直腸癌標(biāo)本共計(jì)97例。所有患者標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為結(jié)直腸癌，術(shù)前未接受任何術(shù)前放、化療及其他抗腫瘤治療，術(shù)后患者均根據(jù)NCCN指南而采用正規(guī)腫瘤內(nèi)科的化療或放療。所有納入研究的患者接受的手術(shù)術(shù)式均為結(jié)直腸癌根治術(shù)。對(duì)照組：癌旁或正常的結(jié)直腸組織標(biāo)本37例標(biāo)本，取自結(jié)直腸癌對(duì)應(yīng)的周邊組織，或良性腫瘤的外圍組織，病理切片HE檢查證實(shí)未受癌侵潤(rùn)及未發(fā)生癌變。記錄主要針對(duì)以下幾項(xiàng)內(nèi)容：患者已經(jīng)死亡者(詢問其死亡時(shí)間、死亡原因是否與結(jié)直腸癌相關(guān))；患者仍存活(詢問患者目前的生存狀態(tài)、荷瘤生存、無病生存，如為腫瘤復(fù)發(fā)，荷瘤生存則記錄腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間或發(fā)生轉(zhuǎn)移的時(shí)間)；無法隨訪(失訪)，記錄失訪時(shí)間；如隨訪期限內(nèi)患者死亡，證實(shí)患者死亡原因，依據(jù)患者死亡原因是否與結(jié)直腸癌相關(guān)，若死于非結(jié)直腸癌或其他疾病、并發(fā)癥，則歸屬失訪。所有患者的隨訪結(jié)果依照設(shè)計(jì)的隨訪內(nèi)容表格進(jìn)行，截至實(shí)驗(yàn)隨訪結(jié)束時(shí)，所有完成隨訪的患者107例中有31例術(shù)后存活，生存期超過5年者計(jì)37例，占同期結(jié)直腸癌手術(shù)患者總數(shù)的34.6%；70例死亡，死于轉(zhuǎn)移者30例，死于結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)者36例，另有4例死于其他疾病。12例發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移但截至隨訪結(jié)束時(shí)仍存活。

1．2試劑和材料

免疫組織化學(xué)所采用的主要試劑是：山羊Smad-4多克隆抗體，；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗、免疫組化試劑盒、DAB顯色劑等；另外實(shí)驗(yàn)采用的其他試劑詳見下文列述。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

所有結(jié)直腸癌組織的標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋后貯存。確診為結(jié)直腸癌后，采用兩步法進(jìn)行免疫組組織化學(xué)染色。對(duì)貯存時(shí)間3年內(nèi)的標(biāo)本采用pH8.0的EDTA修復(fù)液，貯存時(shí)間超過3年的病理標(biāo)本切片采用pH6.0的檸檬酸鹽抗原修復(fù)液。石蠟包埋組織切片采用免疫組織化學(xué)兩步法檢測(cè)結(jié)直腸癌標(biāo)本中Smad-4的表達(dá)，所使用的第一抗體為山羊多克隆抗體，以已知的陽性切片作為陽性對(duì)照，陰性對(duì)照以PBS代替一抗。切片染色后由兩位專業(yè)副高職稱的病理科醫(yī)師分別盲評(píng)閱片、評(píng)定以確定切片各自的陽性結(jié)論。

1.4結(jié)果判定

1.4.1Smad-4表達(dá)的檢測(cè)及評(píng)價(jià)

每張染色確定成功的切片隨機(jī)選取5個(gè)有效視野，摒棄切片的邊緣、組織切片的炎癥壞死區(qū)、大血管經(jīng)過區(qū)、切片刀痕、切片撈片過程中形成的皺折、壞死或擠壓重疊區(qū)域。圖像分析系統(tǒng)對(duì)已判定陽性切片進(jìn)行判定及計(jì)算陽性腫瘤細(xì)胞的百分率：先在100倍光鏡掃視整個(gè)切片，后在400倍光鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，取其平均值作為結(jié)果。

1.4.2染色判定

以每個(gè)視野下的陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)占該視野下總體細(xì)胞百分率(點(diǎn)密度陽性率)以陽性細(xì)胞數(shù)低于10%記為為陰性；10%~25%計(jì)為“+”；25%~50%計(jì)為“”；50%~75%計(jì)為“”；>75%計(jì)為“”。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS13.0進(jìn)行，P<0.05為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Smad-4在結(jié)直腸癌組織中與癌旁組織內(nèi)的表達(dá)

本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌與癌旁組織Smad-4的表達(dá)染色情況經(jīng)兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)，其存在的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。(后續(xù)統(tǒng)計(jì)時(shí)以陰性“+，”納入統(tǒng)計(jì))

表1　Smad-4在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)

2.2Smad-4表達(dá)與預(yù)后生存期的關(guān)系

采用Kaplan-Meier法進(jìn)行的患者生存分析結(jié)果證實(shí)：Smad-4的高表達(dá)與患者的無病生存期關(guān)系密切，即結(jié)直腸癌組織中具有Smad-4高表達(dá)的患者，其術(shù)后總體生存期較低表達(dá)組患者為好，兩相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1　Smad-4高表達(dá)組與低表達(dá)組患者的術(shù)后總生存情況

Kapla-Meier法生存分析:其結(jié)果顯示Smad-4高表達(dá)組(藍(lán)線)與低表達(dá)組(綠線)患者的術(shù)后總生存情況，差異性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3　討論

結(jié)直癌為胃腸道常見的惡性腫瘤之一，近年來在我國(guó)的發(fā)病率有明顯的增高趨勢(shì)[7]。Smad-4基因是首先在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)的新型腫瘤抑制基因，其所編碼的產(chǎn)物蛋白Smad-4是TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最為重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)將外界刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞核內(nèi)，繼而調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄、翻譯的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[8]。業(yè)已證實(shí)，TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路各關(guān)鍵蛋白的的表達(dá)下降或生化功能失活參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9]，這點(diǎn)與本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的Smad-4蛋白的表達(dá)下降與結(jié)直腸癌患者術(shù)后的不良預(yù)后相關(guān)。除此傳統(tǒng)的抑癌功能之外，研究證實(shí)Smad-4蛋白還具備一些獨(dú)立于TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之外的生化功能，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)其他相關(guān)基因的表達(dá)[10]。通過完成此項(xiàng)課題，我們發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中Smad-4的表達(dá)與患者的臨床病理學(xué)指標(biāo)、患者預(yù)后等存在著密切的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，Smad-4在結(jié)直腸癌中存在較高的表達(dá)率，Smad-4陽性表達(dá)的患者其生存率要高于陰性患者，其兩相比較差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其總體患者的中位生存時(shí)間也是表達(dá)陰性者的近兩倍，充分說明Smad-4在結(jié)直腸癌患者中具有重要的臨床評(píng)估價(jià)值和意義?？傮w上講，結(jié)直腸癌患者的預(yù)后評(píng)估應(yīng)該將Smad-4的表達(dá)情況與該腫瘤患者的其他臨床病理資料結(jié)合起來進(jìn)行無疑更科學(xué)、合理、準(zhǔn)確，建議臨床上經(jīng)大樣本、更嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)后推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳瓊，劉志才，程蘭平，等.2003～2007年中國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病與死亡分析[J].中國(guó)腫瘤學(xué)雜志, 2012，21(3): 179-182

[2]Ferlay J, Shin HR, Bray F, et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: Globocan 2008[J]. Int J Cancer，2010，127(12):2893-917

[3] 劉成敏，張成仁，王秀梅.Smads介導(dǎo)的TGF-β信號(hào)通路與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中華腫瘤防治雜志，2010,17(8):631-634

[4]李寧，李麗娟.結(jié)、直腸癌中PRL-3、RhoC的表達(dá)及與浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J]，黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2008，31(2)：14-15

[5]Su E, Han X, Jiang G. The transforming growth factor beta 1/SMAD signaling pathway involved in human chronic myeloid leukemia[J]. Tumori，2010，96(5):659-666

[6] Matsuzaki K. Smad3 phospho isoform-mediated signaling during sporadic human colorectal carcinogenesis[J].Histol Histopathol,2006,21(6):645-662

[7] 王凱峰，衣甜甜.結(jié)腸癌血清中表皮生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)水平及其臨床意義[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2013,36(6)：15-16

[8]Padua D, Massagué. Roles of TGFbeta in metastasis[J].Cell Res，2009，19(1):89-102

[9] Miyaki M, Kuroki T. Role of Smad4 (DPC4) inactivation in human cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun，2003，306(4):799-804

[10] Shiou SR, Singh AB, Moorthy K, et al. Smad4 regulates claudin-1 expression in a transforming growth factor-beta independent manner in colon cancer cells[J]. Cancer Res，2007，67(4):1571-1579

Clinical outcomese expression of Smad-4 in colorectal cancer tissues, its
signal mechanism and its role in the evaluation of patients’ clinical outcomes

WANGXing-quan,WANGYa-zhou,CHENYu-qiang,WANGYue-sheng,LüXin

(Clinical Medical College of Jiamusi University,Jiamusi 154003, China)

Abstract:Objective: To detect colorectal cancer and paracancerous tissues Bby means of immunohistochemical Smad-4 method of detecting colorectal cancer and paracancerous tissues,so as to assesssment of the potential of Smad-4 as the prognosis of patients with colorectal cancer assessment index. Methods: Expression of Smad-4 was detected by immunohistochemistry in 97 cases of colorectal carcinoma tissues and 37 cases of para carcinoma tissues, combined with clinical füollow-up data of a retrospective analysis of expression of Smad-4 in tumors from patients in patients after general no relationship between survival of both. Results: Certain proportion (63 cases) was significantly expressed Smad-4 protein in colorectal cancer tissues,the positive expression rate of [63/97] was 64.94%, higher than that of adjacent normal colorectal mucosa, the positive expression in cells, tissues adjacent to colorectal cancer in the rate of (6 cases) 16.21% [6/37], (P<0.05).The comparison between the two was, different with statistical significance significant differences in the expression of Smad-4 protein and confirmed that ; high, low of the two groups of patients with postoperative survival have significant differences (P<0.05).Conclusions: Smad-4 protein has high expression in tissue of patients with colorectal cancer, there are two kinds of patients with higher Smad-4 surface and low expression in cancer tissue, there was a significant difference, the clinical prognosis. Protein marker Smad-4 protein can be used to evaluate the clinical outcome of patients with rectal cancer after operation nodes of conditional.

Key words:Smad-4;colorectal cancer;immunohistochemistry

中圖分類號(hào)：R735.3+7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1008-0104(2015)06-0077-02

作者簡(jiǎn)介:①王星權(quán)(1988～)男,黑龍江佳木斯人,在讀碩士研究生。

通訊作者:王亞洲(1956～)男,黑龍江佳木斯人,碩士,主任醫(yī)師,教授,碩士研究生導(dǎo)師。E—mail:sln.shm.ily@163.com。

(收稿日期：2015-03-13)