宋振宇，關　鍵 ，關　宏

(1.佳木斯大學，黑龍江 佳木斯154007；2.齊齊哈爾醫(yī)學院，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

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大鼠雪旺細胞培養(yǎng)純化與鑒定①

宋振宇1，關鍵1，關宏2

(1.佳木斯大學，黑龍江 佳木斯154007；2.齊齊哈爾醫(yī)學院，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

摘要：目的：通過Wistar大鼠坐骨神經(jīng)取材，體外預變性與組織塊貼壁方法，培養(yǎng)出大量高純度可以滿足臨床應用條件的雪旺細胞。方法：取200～250g成年大鼠，脫頸處死，完全浸泡在75%酒精消毒10min，俯臥位取雙側坐骨神經(jīng)，體外預變性兩周，之后加入雙酶消化，EGTA試劑純化雪旺細胞，通過免疫熒光鑒定雪旺細胞純度。結果：此研究描述一種新穎有效雪旺細胞培養(yǎng)提純的方法。利用EGTA對雪旺細胞分離比成纖維細胞快的原理提純，需要大約21d完成。該方法具有操作簡單，速度快的優(yōu)勢，比其他先前描述的方法更有效。結論：該實驗通過體外預變性獲得的雪旺細胞增殖能力強，活性好，易貼壁，而且純化方法簡單易行，在較短的時間內獲得高純度雪旺細胞。

關鍵詞：雪旺細胞；Forskolin；EGTA

雪旺細胞在周圍神經(jīng)再生中起到?jīng)Q定性作用，是其核心組成。周圍神經(jīng)損傷后，其迅速大量增值，與巨噬細胞協(xié)同，分泌神經(jīng)生長因子[1]，同時吞噬變性壞死碎片以及促進軸突再生。因此，雪旺細胞的研究，對周圍神經(jīng)再生起到主導作用[2]。因為成纖維細胞要比雪旺細胞的增殖快，兩者的分離提純成為一個復雜的過程。采用預變性的方法要比完整的神經(jīng)取材要更容易獲得活性好和高濃度、高純的雪旺細胞。目前，組織工程學中，把高濃度的雪旺細胞移植到生物材料人工神經(jīng)管道內來修復神經(jīng)損傷促進神經(jīng)再生有重要突破[3]。

1　材料與方法

1.1材料

主要試劑、材料：黑色素細胞培養(yǎng)基、p75NTR的抗體、胎牛血清、二抗FITC、胰蛋白酶、DAPI、膠原酶Ⅳ號、Forskolin、牛腦垂體提取物、成纖維細胞生長因子、EGTA。

1.2方法

①神經(jīng)的預處理：取成年約200～250g 的Wistar大鼠，在無菌條件下麻醉，剝離雙側20~25mm長度的坐骨神經(jīng)。放到PBS緩沖液中，盡量剝除神經(jīng)外膜，用剪刀將組織剪成2~4mm的神經(jīng)段。把坐骨神經(jīng)片段放入到培養(yǎng)基中2周以體外預變性。成纖維細胞可從神經(jīng)組織爬出，培養(yǎng)基DMEM加入了10%(v/v)胎牛血清FBS與1%(W/V)青霉素/鏈霉素。同時，為了提高雪旺細胞的增值，加入2 M forskolin作為雪旺細胞特異性的有絲分裂原。

②神經(jīng)消化分離處理 ：經(jīng)過兩周，將預處理的坐骨神經(jīng)碎片，加入0.125%的膠原酶IV號與1.25 U/mL的中性蛋白酶混合酶各2mL，再放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育20h[4]。之后在室溫2000r/min離心3min棄上清液，得混合雪旺細胞與成纖維細胞。混懸轉移到2g/mL多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿中。24h之后，更換含有2 M Forskolin、10ng/mL FGF和5g/mL牛腦垂體提取物，阻止成纖維細胞的增值分裂。

③雪旺細胞提純：5~6d之后，細胞鋪培養(yǎng)皿底部70%左右。為得到大量雪旺細胞，用2mL不含Ca2+和Mg2+的PBS溶液和2mL 1 Mm EGTA沖洗。在顯微鏡觀察3~4min，細胞收縮分離，漂浮起來的是雪旺細胞，收集懸液，2000r/min離心3min，棄上清，加入1mL DMEM培養(yǎng)基混懸，重復離心去上清，用DMEM培養(yǎng)基混懸，轉移培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3雪旺細胞培養(yǎng)與鑒定

①雪旺細胞形態(tài)：顯微鏡下見，雪旺細胞呈胞體凸起，并發(fā)出兩個長觸角呈梭形或發(fā)出三個觸角呈三角形；而成纖維細胞，呈較大扁平的不規(guī)則形態(tài)[5]。

②免疫熒光染色：雪旺細胞接種在多聚賴氨酸(15 g/mL)涂覆的蓋玻片上，放入到4%多聚甲醛與PBS中，固定30min，再PBS沖洗。加入10%(v/v)山羊血清和1mg BSA/mL的PBS中1h。首先加入由3%(v/v)山羊血清和1mgBSA/mL PBS稀釋的抗體p75NTR 2h或4℃過夜。拿出沖洗細胞加入二抗，羊抗兔IgG共軛熒光素異硫氰酸酯(FITC)在37℃ 45min。沖洗再加入DAPI， 2min后細胞核被染色，用熒光顯微鏡觀察。

③流式細胞儀分析：收集的細胞直接流式細胞儀分析后直接染色，通過測量熒光強度的p75NTR陽性細胞的分數(shù)比例，得出雪旺細胞的百分比。胰蛋白酶消化后用細胞計數(shù)器計數(shù)后流式細胞儀檢測，達到106個雪旺是細胞的純度有意義。

2　結果

2.1原代培養(yǎng)和雪旺細胞增殖

見圖1。離體坐骨神經(jīng)組織經(jīng)過兩周預處理后圖片,膠原酶和中性蛋白酶消化后平均得到(4.0±0.8)×106個細胞/皿。24h大量懸浮細胞貼壁生長，兩種細胞形態(tài)完全不同。以扁平的不規(guī)則形態(tài)和一個卵圓形細胞核呈現(xiàn)的為成纖維細胞；雪旺細胞一般為體積小的、明亮的、兩極的梭形或三極的三角形，有比較長的觸須樣形態(tài)，見圖2。細胞的純度為(64.1±0.7)%。換加入2 M Forskolin、10ng/mL FGF和5g/mL牛腦垂體蛋白提取物培養(yǎng)基之后，成纖維細胞的數(shù)量明顯減少，見圖3。對照組成纖維細胞比例高，未用做進一步研究。用EGTA處理后，見圖4，大部分雙極和三極的細胞收縮、分離、被懸浮釋放；而扁平的不規(guī)則形態(tài)的細胞則沒有發(fā)生這種變化。收集漂浮細胞，轉移至另一新培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。24h細胞貼壁后，圖5。7d后，雪旺細胞純度可達到(99.2±0.4)%。見圖6～8，顯示細胞免疫熒光染色，之后流式細胞儀檢測，顯示大于99%的細胞對p75NTR標記陽性，為雪旺細胞。

圖1　預處理兩周(×10)　　　圖2　消化后培養(yǎng)24h(×10)　　　圖3　換培養(yǎng)基后(×10)

圖4　培養(yǎng)后用EGTA純化過程(×10)　　　　圖5　EGTA純化后貼壁24h(×10)

圖6　加入抗體后染色(×20)　　圖7　細胞核染色(×20)　　　圖8　合成后效果圖(×20)

3　討論

這項研究敘述了一個比較高效的提純和獲得大量雪旺細胞的實驗程序。當與未經(jīng)處理的神經(jīng)相比[6]，體內和體外采用預變性處理而得到活性雪旺細胞是一種簡單有效增加細胞產(chǎn)量的方法。當暴露于Forskolin兩周預變性后雪旺細胞產(chǎn)量、純度和細胞增值率增加，所以我們采用這個方法。這個新的研究方法涉及到加入EGTA試劑后，雪旺細胞和成纖維細胞分離的不同，雪旺細胞可以攣縮呈橢圓狀以至分離漂浮，這要可以純化雪旺細胞。這種方法的關鍵點在于一個合適的細胞外基質的應用，一個理想的基質可以讓雪旺細胞和成纖維細胞差動分離。因此，在本研究中我們測試了不同濃度的層黏連蛋白或多聚賴氨酸作為細胞外基質。我們觀察得到，使用2g/mL多聚賴氨酸，分離雪旺細胞與成纖維細胞效果更明顯。其一，細胞接種密度過大，雪旺細胞與成纖維細胞重疊影響分離。本研究認為的密度為7.5×104個/cm2，這低于之前研究的雪旺細胞和成纖維細胞混合的密度。其二，細胞增殖不同，在第一個48h內，雪旺細胞增殖要比成纖維快，但72h后成纖維細胞會迅速的增值，把雪旺細胞覆蓋。為了解決這個問題，我們要換加入抑制成纖維細胞增殖試劑的培養(yǎng)基。此外，用能分離雪旺細胞的EGTA試劑處理，成纖維細胞密度過大將影響分離效果。在細胞特征結合形態(tài)學觀察，細胞純度可以達到99%。根據(jù)文獻差速貼壁分離和膠原酶處理等方法，通過實踐沒有達到這個純度?？傊?，使用EGTA對兩種細胞分離處理，是在短時間內，獲得高純度雪旺細胞的方法之一。為雪旺細胞的臨床研究奠定了基礎。

參考文獻：

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[2]孫煥偉, 張鐵慧, 由欣巖, 等. 不同濃度許旺細胞與聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物修復損傷周圍神經(jīng)的比較[J]. 中國組織工程研究, 2014, (47): 7579-7584

[3]周翔. 雪旺細胞與異種骨支架的體外復合培養(yǎng)研究[D]. 第四軍醫(yī)大學, 2014

[4]李陳, 肖玉周. 施萬細胞培養(yǎng)與純化研究進展[J]. 醫(yī)學綜述, 2014, (08): 1371-1373

[5]嚴廣斌, 盧永輝, 錢東陽, 等. 施萬細胞從兔變性坐骨神經(jīng)中的分離、純化和培養(yǎng)[J]. 廣東醫(yī)學, 2013, (20): 3108-3110

[6]姜葉. 乳鼠坐骨神經(jīng)雪旺細胞體外培養(yǎng)的實驗研究[D]. 青島大學, 2014

中圖分類號：R338.1

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2015)06-0050-02

(收稿日期：2015-06-08)