項亮亮，侯　杰，王　婕，焦成斌

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外二科，黑龍江 佳木斯 154003)

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小鼠肝癌原位移植模型的建立及其意義的研究①

項亮亮，侯杰，王婕，焦成斌

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外二科，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：探討用肝癌H22細胞建立小鼠肝癌原位移植模型。方法：將肝癌H22細胞注入小鼠腹腔內(nèi)，建立異位移植模型；抽取腹水中癌細胞接種于小鼠肝實質(zhì)內(nèi)，建立原位移植模型。結(jié)果：移植后10d可捫及腫瘤生長，模型成功率94.4%；晚期自發(fā)轉(zhuǎn)移率79.4%，腹水產(chǎn)生率35.3%，無自發(fā)消退；移植瘤保持甲胎蛋白(AFP)、異常凝血酶原(DCP)高分泌及γ-氨基酰轉(zhuǎn)氨酶(γ-GT)同工酶陽性的特點；模型平均自然生存期28d。結(jié)論：小鼠肝癌原位模型成功率高，易于制作，生物學(xué)特征符合模擬人類肝癌在體內(nèi)發(fā)生發(fā)展的全過程，可成為今后人類研究肝癌的重要動物模型。

關(guān)鍵詞：肝癌；H22細胞；原位移植模型；小鼠

肝癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，因其發(fā)病率高、惡性程度高、死亡率高，素有“癌中之王”的稱號[1]。目前已有大量研究為肝癌臨床的治療提供基礎(chǔ)依據(jù)，而肝癌動物模型一直是肝癌臨床與基礎(chǔ)研究工作的重要工具。目前有關(guān)人腫瘤轉(zhuǎn)移模型大多是用裸大鼠、裸小鼠,動物腫瘤則多數(shù)是用Wistar或SD大鼠建立的,而用小鼠建立原位腫瘤移植模型國內(nèi)外報道較少。小鼠作為一種更經(jīng)濟，易飼養(yǎng)，易獲得的實驗研究載體，在發(fā)揮其普遍應(yīng)用性方面有著重大的作用。小鼠肝癌原位移植模型作為一種新型的動物模型是否能更好地模擬人肝癌在體內(nèi)發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的過程，本實驗將研究報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物及瘤株

SPF級昆明小鼠40只，雄性，鼠齡5周齡，體重約18~22g；腹水型肝癌H22細胞株，由佳木斯大學(xué)中心實驗室代為凍存。

1.2實驗儀器及材料

臺式低溫高速離心機、切片機、光學(xué)顯微鏡、游標卡尺、電子精密天平、無菌操作臺、10%福爾馬林固定液、水合氯醛、伊紅、蘇木素、瓊脂糖等。

1.3模型制作

1.3.1異位模型制作：將凍存的肝癌H22細胞株復(fù)蘇，體外培養(yǎng)至對數(shù)期后，以生理鹽水調(diào)整細胞濃度至1×107個/mL,每只小鼠腹腔內(nèi)注射0.5mL，共4只。注射7d后在無菌條件下抽出腹水，離心,去除雜質(zhì)細胞，調(diào)整癌細胞濃度至1×107個/mL備用，進行原位移植[2]。

1.3.2原位模型制作：采取開腹手術(shù)直接注入肝臟法。昆明小鼠共36只。(1)取5周齡小鼠，抓取固定，腹部剃毛，75%醫(yī)用酒精消毒，按小鼠體重的0.3%比例行水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉起效后，將小鼠四肢固定小手術(shù)臺上，腹部再次消毒，取劍突下上腹部正中切口，長約1.2cm，剪開皮膚、腹白線及腹膜，壓迫止血，輕輕擠壓小鼠雙側(cè)腹壁，將小鼠肝左葉擠壓出腹腔。(2)取無菌注射器將0.1mLH22腫瘤細胞注入左肝實質(zhì)內(nèi)，退出針頭，輕壓針眼，取燒紅的鐵絲輕灼針眼，防止腫瘤細胞逃逸，發(fā)生腹腔種植，將肝左葉輕輕送回腹腔。(3)查無活動性出血，取1號絲線縫合腹壁各層，消毒，小創(chuàng)口貼切口黏貼，結(jié)束造模。

1.4觀察指標及方法

1.4.1模型觀察：定期觀察荷瘤小鼠生存、活動狀況及腹部體征。捫查腹部了解移植瘤形成時間、質(zhì)地及大小，以小鼠腹部可觸及實體性包塊為成瘤標志。留取10只荷瘤小鼠觀察其帶瘤的自然生存期。

1.4.2解剖學(xué)及病理學(xué)觀察：當(dāng)小鼠出現(xiàn)消瘦、精神萎靡等體征時處死小鼠。開腹肉眼觀察腫瘤生長部位、質(zhì)地、活動度、浸潤、腹水及腹腔轉(zhuǎn)移情況。游標卡尺測量瘤體的長(l)、寬(w)、高(h)，體積(v)= π(l×w×h)/6計算[3，4]。10%福爾馬林液固定瘤體，石蠟包埋，切片，經(jīng)HE染色作常規(guī)病理檢查。

1.4.3血清學(xué)檢測：小鼠處死前，采用眼球摘除法取血，及時分離血清。ELISA法檢測AFP[5]、DCP[6]，γ-GTⅡ檢測用聚丙烯酰胺凝膠梯度電泳法分離，凡出現(xiàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶任一條即可判定結(jié)果陽性[7]。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包，計量資料采用均數(shù)加減標準差表示。

2　結(jié)果

2.1造模情況

模型成功率達94.4%(34/36)。移植5d左右小鼠皮膚傷口愈合。10d左右中上腹可捫及直徑約0.4～0.6cm，位置固定、質(zhì)地稍軟的實體腫塊。14d可捫及較明顯的腫塊，隨后腫瘤生長速度增快，腫瘤大小略有差異。21d瘤徑達2.0cm左右，可見腹部膨隆，部分小鼠出現(xiàn)消瘦、精神萎靡、行動遲緩等現(xiàn)象。模型平均自然生存期28d。

2.2大體解剖觀察

移植瘤形態(tài)相對規(guī)則，成圓形或橢圓形，大部分暗紅色，局部為白色，實質(zhì)性，質(zhì)較硬，與周圍肝組織間完全或部分包膜包繞，表面有大小不等的結(jié)節(jié)，以浸潤性生長為主，見圖1。21d原位模型移植瘤平均體積(664.28±72.63)mm3，平均重量(1.54±0.23)g，晚期出現(xiàn)肝內(nèi)、皮下及腸系膜腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率79.4%(27/34)，大量腹水占35.3%(12/34)。

圖1　移植21d后腫瘤大小(構(gòu)2.0cm)

2.3病理組織觀察

HE染色光鏡下觀察癌細胞表面不規(guī)則，分化程度差，核大成圓形，深染，核質(zhì)比大，游離核糖體增多等；腫瘤邊緣浸潤肝組織，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)可見大量癌細胞，排列緊密，見圖2。

圖2　腫瘤組織病理切片(HE×400)

2.4血清AFP、DCP及γ-GTⅡ檢測

移植瘤保持了癌細胞分泌AFP、DCP，γ-GT的特點，且γ-GTⅡ檢測均為陽性。

3　討論

肝癌動物模型的建立包括誘發(fā)性、轉(zhuǎn)基因及移植型，移植型又包括異位移植型及原位移植型。前兩種動物模型由于自發(fā)性肝癌發(fā)病率低且模型穩(wěn)定率差、病變的發(fā)生時間較難預(yù)測，且成本高、模型成功率低、癌細胞的形態(tài)學(xué)及免疫學(xué)特征常多樣，所以具有一定的研究局限性[8]。異位移植模型雖能維持來源腫瘤的組織結(jié)構(gòu)及生物特性，但很少發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而影響了在研究人類腫瘤轉(zhuǎn)移特性方面的價值。原位移植是二十世紀八十年代逐漸發(fā)展起來的一種移植方式，與異位移植相比可以更好地再現(xiàn)臨床腫瘤在人體內(nèi)發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的全過程[9]。我們利用移植經(jīng)腹水傳代的H22腫瘤細胞成功的建立了小鼠肝癌原位移植模型，制模周期短、成本低，成功率高達94.4%，轉(zhuǎn)移率為79.4%，且降低了早期腹水的發(fā)生率，晚期大量腹水占35.3%，未發(fā)現(xiàn)自發(fā)性消退，還保持了絕大多數(shù)的生物學(xué)特性，包括腫瘤的組織結(jié)構(gòu)，AFP、DCP高分泌與γ-GTⅡ陽性的特點，基本模擬了人類肝癌的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移的自然過程，適用于對肝癌的藥物治療及侵襲、轉(zhuǎn)移機制方面的研究。本實驗表明，小鼠肝癌原位移植模型可成為今后人類研究肝癌的重要動物模型。

本實驗?zāi)軌虺晒⑿∈蟾伟┰灰浦材Ｐ筒l(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的主要原因歸結(jié)于以下幾方面:(1)精確的麻醉技術(shù)和熟練的手術(shù)技巧是減少小鼠因過麻死或手術(shù)出血過多而死亡的關(guān)鍵，更是模型成功的重中之重；(2)嚴格無菌操作，防止因感染造成小鼠死亡影響實驗結(jié)果；(3)利用自身的腹水提取癌細胞，其性質(zhì)穩(wěn)定，異質(zhì)性小，直接接種于原位環(huán)境更有利于在體內(nèi)生長；(4)接種鼠在性別選擇上，盡量為雄性小鼠，以防激素依賴性影響實驗結(jié)果；(5)在小鼠體重選擇上，以18~22g為宜，體重過輕則因肝臟過小增加手術(shù)難度，反之增加肝臟的排斥反應(yīng)影響移植瘤的生長；(6)癌細胞本身具有較強的惡性行為表達能力；(7)開腹直接接種腫瘤細胞，用燒紅的鐵絲輕灼針眼，減少術(shù)中出血，防止腫瘤細胞逃逸等造成腹腔種植及早期腹水的形成。

參考文獻：

[1]王偉麗,高英堂.肝癌相關(guān)基因及相互作用的研究進展[J].世界華人消化雜志,2008,29:3289-3294

[2]侯杰,羅蘭,劉偉新. H22昆明鼠肝癌原位模型的建立[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2015,38(1):78-79

[3]Iwanuma Y ,Chen F, Egilmez N ,at al.Antitumor immune response of human periperal blood lymphocytes coengrafted with tumor into severe combined immmunodeficient mice[J]. Cancer Research，1997,57(14):2937-2942

[4]何志軍,陳先祥,蔡慶和,等.移植瘤體積不同計測方法的比較[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2009,09:47-50

[5]馬麗艷.血清AFP、CEA和CA199聯(lián)合對原發(fā)性肝癌的診斷價值[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2011,34(1)：80

[6]Yamamoto K, Imamura H, Matsuyama Y, et al. AFP, AFP-L3, DCP, and GP73 as markers for monitoring treatment response and recurrence and as surrogate markers of clinicopathological variables of HCC[J]. Journal of Gastroenterology，2010 ,45(12):1272-1282

[7]Sawabu N.Clinical evaluation of specific γ-GT isoenjyme in patients with hepatocelluar carcinoma [J].Cancer,1983,51:327-332

[8]陳謙,孫慧,李強. 醫(yī)學(xué)實驗肝癌動物模型的研究進展[J].中華實驗外科雜志,2006,03:377-378

[9]Furukawa T, Fu X ,Kubota T, et al.Nude mouse metastatic models of human stomach cancer constructed using orthotopic implantation of histologically intact tissue[J]. Cancer Research，1993,53(5):1204-1208

中圖分類號：R735.7

文獻標識碼：B

文章編號：1008-0104(2015)06-0048-02

基金項目：①佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項目，編號:LM2014-018。

作者簡介：項亮亮(1989～)男，安徽安慶人，在讀碩士研究生。

通訊作者：焦成斌(1965～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:JiaoChengBin2009@sina.com。

(收稿日期：2015-06-06)