初而復(fù),屈瑋婷,李　欣,張明亮,盧均坤

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.齊齊哈爾建華醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

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Slc25a3基因在低硒大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)①

初而復(fù)1,屈瑋婷2,李欣1,張明亮1,盧均坤1

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.齊齊哈爾建華醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

摘要:目的:探討低硒狀態(tài)下SD大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Slc25a3基因的表達(dá)情況。方法:將24只正常成年雄性SD大鼠隨機(jī)等分為低硒組和正常組。兩組大鼠分別給予低硒飲食及正常飲食。飼養(yǎng)4周后，進(jìn)行動(dòng)物模型鑒定實(shí)驗(yàn)。采用熒光法檢測(cè)兩組大鼠主要臟器的硒含量、采用谷胱甘肽過(guò)氧化物酶試劑盒檢測(cè)肝臟中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶1(GPx-1)的活性、采用Real-time PCR方法檢測(cè)GPx-1的mRNA水平的相對(duì)表達(dá)、采用丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒和超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒檢測(cè)兩組動(dòng)物模型主要臟器中MDA含量和SOD活性；8周后，脊髓離斷處死全部大鼠，取心臟組織進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:低硒組大鼠體內(nèi)主要臟器硒含量均明顯低于對(duì)照組，氧化應(yīng)激水平明顯高于對(duì)照組，心肌細(xì)胞內(nèi)Slc25a3基因相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。結(jié)論:硒元素缺乏可以導(dǎo)致大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Slc25a3基因相對(duì)表達(dá)量明顯升高。

關(guān)鍵詞：低硒；大鼠；MPTP；氧化應(yīng)激；Slc25a3基因

線粒體是細(xì)胞物質(zhì)與能量代謝的重要場(chǎng)所，它能通過(guò)電子傳遞鏈的氧化磷酸化反應(yīng)為有機(jī)體提供90%的ATP能源，維持機(jī)體的各項(xiàng)生理機(jī)能[1]。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)大量開(kāi)放是導(dǎo)致線粒體功能障礙的關(guān)鍵[2]。PiC是位于線粒體內(nèi)膜上的一種重要的功能蛋白，其功能主要是使重要的代謝底物：無(wú)機(jī)磷酸(Pi)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體基質(zhì)[3]。研究表明，PiC可以在MPTP開(kāi)放中發(fā)揮重要作用[4]。PiC由多種編碼基因共同調(diào)控，其中Slc25a3基因是編碼PiC基因的重要組成部分，研究發(fā)現(xiàn)PiC的表達(dá)量與Slc25a3的表達(dá)情況密切相關(guān)[5]。

微量元素硒(selenium, Se)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一種必需微量元素，在機(jī)體內(nèi)許多生物學(xué)過(guò)程中都發(fā)揮著重要功能。研究證實(shí)，硒元素缺乏可以導(dǎo)致心血管、內(nèi)分泌、生殖等多個(gè)系統(tǒng)功能發(fā)生異常，與很多疾病的發(fā)生及發(fā)展有密切的關(guān)系[6]。但硒元素缺乏是否可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)能量代謝發(fā)生異常改變，尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)構(gòu)建低硒動(dòng)物模型，對(duì)低硒大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Pic基因的表達(dá)情況進(jìn)行研究，從而揭示了低硒狀態(tài)下，大鼠心肌細(xì)胞能量代謝變化的可能途徑。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料

正常成年雄性SD大鼠24 只，體重180~220g，均購(gòu)買自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；正常飼料，購(gòu)買自佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；自制低硒飼料，以低硒酵母為主要原料，同時(shí)加入蔗糖、各種維生素以及除硒元素以外的各種微量元素配制而成的粉末狀飼料。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑盒(南京碧云天，中國(guó))，超氧化物歧化酶檢測(cè)試劑盒(南京碧云天，中國(guó))，丙二醛檢測(cè)試劑盒(南京碧云天，中國(guó))，Trizol(Invitrogen，美國(guó))，DEPC(Sigma，美國(guó))，ABI SybrGreen PCR Master Mix(ABI，美國(guó))，引物(上海生工公司，中國(guó))，抗體(Santa, 美國(guó))。

1.3動(dòng)物模型建立

兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在清潔級(jí)動(dòng)物室中進(jìn)行飼養(yǎng)。將24 只正常成年雄性SD大鼠隨機(jī)等分為低硒組和正常組。低硒組給予自制低硒飼料及去離子水喂養(yǎng)，正常組給予正常飼料及高溫滅菌后的自來(lái)水喂養(yǎng)。飼養(yǎng)4 周后，隨機(jī)選取兩組各6 只大鼠確定低硒動(dòng)物模型建立是否成功。脊髓離斷處死大鼠，分別取心臟、肝臟、腎臟組織以及采集下腔靜脈中靜脈血液，采用熒光法檢測(cè)兩組大鼠主要臟器的硒含量、采用谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Gpx)試劑盒檢測(cè)肝臟中GPx-1的活性[7]、采用Real-time PCR檢測(cè)GPx-1的mRNA表達(dá)情況、采用丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒和超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒檢測(cè)兩組大鼠主要臟器的MDA含量[8]和SOD活性[9]；8周后，剩余全部大鼠采用脊髓離斷的方法處死，取心臟組織進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。

1.4低硒動(dòng)物模型鑒定

取適量組織樣本在冰浴下用勻漿器勻漿，用生理鹽水制成10%的組織勻漿，4℃ 3000rpm離心10min，取上清液檢測(cè)。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明，檢測(cè)兩組大鼠主要臟器內(nèi)硒含量，兩組大鼠肝臟組織內(nèi)GPx-1活性及其mRNA表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)兩組大鼠各臟器SOD活力及MDA含量，所有操作步驟均嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5Real-time PCR檢測(cè)PiC基因的表達(dá)

心臟組織RNA提取采用Trizol試劑提取方法。采用AMV First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒于PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀(ABI，美國(guó))上將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Real-time PCR 采用ABI SybrGreen PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)在20 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用Livak法即2-(ΔΔCt)法對(duì)PCR的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。本實(shí)驗(yàn)中的引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，各組間的數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)分析，以P<0.05為有顯著性差異。

2　結(jié)果

2.1兩組大鼠肝臟、心臟、腎臟及靜脈血液硒含量檢測(cè)

結(jié)果顯示，低硒組大鼠的肝臟、心臟、腎臟以及靜脈血液的硒含量均明顯低于正常組(*P<0.01)。我們發(fā)現(xiàn)，低硒組大鼠的肝臟硒含量為正對(duì)照組的36.13 %(A)，心臟硒含量為正常組的56.42 %(B)，腎臟硒含量為對(duì)照組的34.88 %(C)，靜脈血液硒含量為對(duì)照組的37.05 %(D),見(jiàn)圖1。

圖1　兩組大鼠肝臟(A)、心臟(B)、腎臟(C)及靜脈血液(D)硒含量檢測(cè)

2.2兩組大鼠肝臟GPx-1活性及其mRNA表達(dá)

結(jié)果顯示，低硒組大鼠肝臟內(nèi)GPx-1的活性及其mRNA表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組(*P<0.01)。通過(guò)對(duì)低硒組大鼠肝臟中含硒蛋白GPx活性的檢測(cè)說(shuō)明低硒組大鼠體內(nèi)硒含量的缺乏，導(dǎo)致了含硒蛋白活性的減低，而GPx-1基因mRNA表達(dá)下調(diào)也進(jìn)一步證明了低硒動(dòng)物模型建立成功，見(jiàn)圖2。

圖2　母體SD大鼠肝臟GPx-1活性

2.3兩組大鼠MDA含量與SOD活性的測(cè)定

結(jié)果顯示，低硒組大鼠主要臟器MDA含量明顯高于對(duì)照組(A)，而SOD活性低于對(duì)照組(B)(*P<0.01)。結(jié)果表明，低硒組大鼠處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)。研究證實(shí)哺乳動(dòng)物體內(nèi)硒元素缺乏可以使機(jī)體處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)，因此本結(jié)果間接證明低硒動(dòng)物模型建立成功[14]，見(jiàn)圖3。

圖3　兩組大鼠各臟器MDA含量(A)及SOD活力(B)檢測(cè)

2.4Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)Slc25a3基因的表達(dá)

結(jié)果顯示，低硒組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Slc25a3基因相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4　兩組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Slc25a3基因的表達(dá)

3　討論

微量元素硒是機(jī)體的一種必需微量元素，在許多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要功能。硒的生物學(xué)作用主要是通過(guò)硒蛋白來(lái)體現(xiàn)的。機(jī)體要不斷攝入外源硒來(lái)維持體內(nèi)硒平衡。因此當(dāng)食物或飼料中硒含量降低，生物就會(huì)處于全身硒水平較低的狀態(tài)。MPTP大量開(kāi)放是導(dǎo)致線粒體功能障礙的關(guān)鍵，而PiC是構(gòu)成MPTP的關(guān)鍵性線粒體內(nèi)膜成分。研究證實(shí)肌間纖維線粒體Slc25a3合成顯著減少，ATP合成也顯著減少，隨著線粒體蛋白組學(xué)異常，心臟功能失調(diào)[10]。本研究通過(guò)建立低硒SD大鼠模型，對(duì)低硒大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Pic基因的表達(dá)情況進(jìn)行研究，從而揭示了低硒狀態(tài)下，大鼠心肌細(xì)胞能量代謝變化的可能途徑。研究表明，PiC是構(gòu)成MPTP的關(guān)鍵性成分，心肌細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的改變是影響PiC基因表達(dá)的一個(gè)重要因素，因此PiC的顯著升高可以導(dǎo)致MPTP的大量開(kāi)放，從而引起線粒體功能出現(xiàn)異常[11]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)低硒和正常兩種狀態(tài)下，大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)PiC基因的表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比，旨在揭示硒元素在哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞內(nèi)可以發(fā)揮重要作用，缺乏硒元素可導(dǎo)致心肌細(xì)胞能量代謝發(fā)生明顯改變，為下一步的人體研究提供了基礎(chǔ)研究的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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中圖分類號(hào)：R-332;Q505

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0104(2015)06-0033-02

基金項(xiàng)目：①1.黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目，編號(hào)：H201365；2.佳木斯大學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目，編號(hào)：Sz2013-004；3.佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào)：LZZ2015_017。

作者簡(jiǎn)介：初而復(fù)(1985～)男，山東煙臺(tái)人，在讀碩士研究生。

通訊作者：盧均坤(1972～)男，山東日照人，碩士，副教授，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：ljkuuu@163.com。

(收稿日期：2015-09-16)