浙江省抗癌協(xié)會(huì)抗癌藥物專業(yè)委員會(huì)專家組

●專家解讀

浙江省非小細(xì)胞肺癌血液EGFR基因突變檢測(cè)專家共識(shí)

浙江省抗癌協(xié)會(huì)抗癌藥物專業(yè)委員會(huì)專家組

肺癌是目前我國(guó)發(fā)病率及死亡率最高的腫瘤，早期診斷、精準(zhǔn)治療、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，對(duì)提高肺癌的整體治療水平和治療效果尤為重要。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）約占所有肺癌的80%～85%，以表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）為靶點(diǎn)的小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI）為晚期NSCLC的治療帶來(lái)了新的曙光；而EGFR基因突變狀態(tài)是決定EGFR-TKI療效最重要的預(yù)測(cè)因子，檢測(cè)EGFR基因的突變狀態(tài)是決定患者是否能夠應(yīng)用EGFR-TKI治療的先決條件[1]。

腫瘤組織樣本（手術(shù)、活檢、細(xì)胞蠟塊）是檢測(cè)晚期NSCLC EGFR突變狀態(tài)最適合的樣本來(lái)源。然而并非所有患者都能提供足夠的組織樣本，可通過(guò)經(jīng)支氣管鏡、經(jīng)皮肺穿刺活檢或胸腔積液標(biāo)本來(lái)進(jìn)行突變檢測(cè)，但仍不能覆蓋所有晚期患者[2-3]。在IFUM研究中，僅19%的入組患者能夠到檢測(cè)腫瘤EGFR突變狀態(tài)，無(wú)法檢測(cè)的原因包括：無(wú)法活檢，腫瘤組織樣本的質(zhì)量不合格或所含腫瘤細(xì)胞數(shù)量不夠等[4]；組織標(biāo)本存在空間和時(shí)間的異質(zhì)性也給腫瘤基因的精準(zhǔn)檢測(cè)帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。而近年來(lái)的研究顯示存在于外周血中的游離腫瘤DNA（ctDNA）與腫瘤組織基因組DNA具有極為相似的遺傳學(xué)特性[5-6]，且在腫瘤患者中外周血ctDNA含量顯著高于健康人群。數(shù)據(jù)顯示血液EGFR檢測(cè)水平已經(jīng)接近組織檢測(cè)的水平，配對(duì)樣本檢測(cè)一致性在60%～95%之間[7]。2014年9月歐洲藥品管理局已批準(zhǔn)可采用ctDNA標(biāo)本來(lái)評(píng)估EGFR突變狀態(tài)。中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（CFDA）在2015年2月也已批準(zhǔn)Gefitinib說(shuō)明書(shū)更新，在推薦所有NSCLC患者的腫瘤組織都應(yīng)進(jìn)行EGFR突變檢測(cè)基礎(chǔ)上，補(bǔ)充了如果腫瘤標(biāo)本不可評(píng)估，則可使用從血液（血漿）標(biāo)本中獲得的ctDNA。

血液ctDNA EGFR檢測(cè)具有無(wú)創(chuàng)、便捷、實(shí)時(shí)可獲取的特點(diǎn)能在一定程度上幫助解決組織樣本量不足、異質(zhì)性及反復(fù)動(dòng)態(tài)活檢的問(wèn)題。但目前血液ctDNA EGFR檢測(cè)尚存在臨床應(yīng)用范圍、適用人群、檢測(cè)方法等方面標(biāo)準(zhǔn)的不統(tǒng)一，如何有效合理的應(yīng)用血液EGFR檢測(cè)已成為臨床上亟待解決的問(wèn)題。2015年5月，浙江省抗癌協(xié)會(huì)抗癌藥物專業(yè)委員會(huì)在杭州組織我省相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜曳磸?fù)討論了針對(duì)目前血液檢測(cè)臨床應(yīng)用的幾個(gè)重點(diǎn)問(wèn)題，并就浙江省NSCLC血液EGFR基因突變檢測(cè)的每個(gè)問(wèn)題逐一討論并形成共識(shí)，具體如下：

1 哪一種方法更加適合血液樣本的EGFR檢測(cè)？

目前已有許多血液EGFR基因突變檢測(cè)方法的報(bào)道，如高分辨熔點(diǎn)曲線分析法（HRM）、變性高效液相色譜技術(shù)（DHPLC）、突變擴(kuò)增阻遏系統(tǒng)（ARMS法）、數(shù)字PCR方法等[8-10]。不同血漿游離核酸EGFR檢測(cè)方法各有優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)。

HRM利用不同長(zhǎng)度DNA序列具備不同溶解曲線特性，擴(kuò)增后直接運(yùn)行高分辨溶解完成對(duì)樣本的突變分析，操作簡(jiǎn)單。然而其只能分析純度單一的小片段DNA，并要求有足夠的PCR模板才能得到穩(wěn)定可靠的結(jié)果。DHPLC基于發(fā)生錯(cuò)配的雜合與完全匹配的純合雙鏈DNA解鏈特征差異分離。但DHPLC不能檢測(cè)突變類型，結(jié)果判讀容易出錯(cuò)，并且多個(gè)檢測(cè)步驟增加了工作量[11]。數(shù)字PCR在血漿EGFR突變檢測(cè)上具有較高的靈敏度和特異度[12-13]，但目前報(bào)道的該方法檢測(cè)EGFR突變位點(diǎn)相對(duì)有限（19外顯子缺失，21號(hào)外顯子L858R突變以及20號(hào)外顯子T790M突變），仍處在摸索、累積經(jīng)驗(yàn)階段；其對(duì)操作人員和環(huán)境均有較高的要求，未來(lái)應(yīng)用于臨床尚需大規(guī)模臨床數(shù)據(jù)驗(yàn)證。以二代測(cè)序技術(shù)（NGS）為代表的新技術(shù)擴(kuò)展了基因突變檢測(cè)的深度和廣度[14]，但其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用更需要海量數(shù)據(jù)積累。

目前成熟且常用檢測(cè)血液EGFR基因突變的方法是ARMS法，相比于腫瘤組織EGFR檢測(cè)，該方法檢測(cè)血漿EGFR敏感型突變的靈敏度在65%～88%，特異度在90%～100%[15-17]。

專家組推薦：檢測(cè)基因突變常用的方法是ARMS法，歐盟批準(zhǔn)用于指導(dǎo)Gefitinib治療的血液檢測(cè)方法也是ARMS檢測(cè)方法[15-17]。檢測(cè)方法必需都進(jìn)行嚴(yán)格的驗(yàn)證及質(zhì)控，檢測(cè)試劑須使用經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)的檢測(cè)試劑盒。

2 血液EGFR檢測(cè)能否替代組織樣本，還是作為一個(gè)補(bǔ)充方案？

2.1 血液檢測(cè)與組織檢測(cè)的一致性 IFUM研究中ctDNA標(biāo)本檢測(cè)EGFR突變的高特異度（99.8%）和高靈敏度（65.7%）支持ctDNA可作為NSCLC患者EGFR基因突變檢測(cè)的樣本[16]。因此，歐洲藥品管理局2014年9月已批準(zhǔn)可采用ctDNA標(biāo)本評(píng)估EGFR突變狀態(tài)，進(jìn)而鑒別出最可能從EGFR-TKI治療中受益的NSCLC患者[18]。Liu等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，與組織樣本相比，血漿EGFR基因突變檢測(cè)靈敏度為67.5%，特異度為100%；同時(shí)，方法學(xué)比較顯示ARMS方法是檢測(cè)血漿中EGFR基因突變的最佳方法，該數(shù)據(jù)與IFUM研究結(jié)果一致。因此，中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局在2015年2月已批準(zhǔn)Gefitinib說(shuō)明書(shū)更新。IGNITE研究表明幾乎一半的組織陽(yáng)性患者血漿中可以直接檢測(cè)到EGFR突變，NSCLC患者血漿中EGFR突變率腺癌為26.3%，非腺癌為6.9%[19]。

2.2 血液EGFR突變狀況與臨床療效 IPASS研究中日本亞組人群血清ctDNA EGFR突變狀況（ARMS法）與臨床療效的研究數(shù)據(jù)提示，血清ctDNA EGFR突變陽(yáng)性的患者接受Gefitinib治療較標(biāo)準(zhǔn)化療的無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間（PFS）顯著延長(zhǎng)（HR 0.29）[17]。歐洲IFUM研究也提供了在高加索人群基于血漿ctDNA EGFR突變陽(yáng)性的NSCLC患者（ARMS法）接受Gefitinib治療的療效證據(jù)，在腫瘤組織陽(yáng)性，腫瘤組織和血漿標(biāo)本均陽(yáng)性及腫瘤組織陽(yáng)性而血漿標(biāo)本陰性3組中，其客觀緩解率分別為70%、76.9%、59.5%[16]。在FASTACT2研究中，血漿EGFR突變患者接受Erlotinib與化療聯(lián)合治療的客觀緩解率（74.6%、19.7%）和PFS（HR 0.21）均優(yōu)于單純化療組[20]。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)230例晚期NSCLC患者的臨床觀察[21]及其他多項(xiàng)臨床研究都顯示血液標(biāo)本的EGFR突變對(duì)于預(yù)測(cè)靶向藥物治療的臨床獲益與組織突變者高度一致。

專家組推薦：雖然血液檢測(cè)與組織樣本檢測(cè)一致性在60%～95%之間，血液EGFR檢測(cè)靈敏度尚有提升的空間，組織樣本檢測(cè)仍然是金標(biāo)準(zhǔn)。血液檢測(cè)用于篩選EGFR-TKI適治患者是重要補(bǔ)充，特別是對(duì)于沒(méi)有合適組織標(biāo)本供突變檢測(cè)的患者，可作為組織檢測(cè)的補(bǔ)充[16]。

3 EGFR血液檢測(cè)適用于哪些NSCLC患者？

血漿游離DNA在腫瘤患者中的含量高于健康人，這為血液檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)，Wang等[22]研究發(fā)現(xiàn)NSCLC和健康對(duì)照外周血中游離DNA含量分別為5.82ng/μl和4.37ng/μl（P＜0.001）。但并非是所有患者都適用于血液EGFR檢測(cè)，不同疾病分期患者的血液ctDNA含量是不同的。Bettegowda等[23]比較了不同期別腫瘤中ctDNA的檢出率，結(jié)果顯示Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別為47%、55%、69%和82%，相關(guān)系數(shù)0.337，這說(shuō)明ctDNA含量與腫瘤分期相關(guān)。而EGFR的豐度只有在ctDNA達(dá)到一定檢出限時(shí)才可以被檢測(cè)到，在Ⅲ期以下的患者檢測(cè)的靈敏度不高，因此最為適合的是Ⅲ～Ⅳ期患者。

血液檢測(cè)可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)EGFR基因突變的變化，特別是耐藥突變的出現(xiàn)；Oxnard等[12]用數(shù)字PCR檢測(cè)NSCLC患者血漿T790M突變，檢測(cè)靈敏度為0.5%～0.05%，特異度為100%，可在影像學(xué)進(jìn)展前16周檢測(cè)出血漿T790M突變，并且與19號(hào)外顯子缺失突變量呈平行的變化關(guān)系。今年ASCO上Zheng等[24]報(bào)道了EGFR-TKI治療后耐藥的NSCLC患者外周血ctDNA中T790M突變的檢出率為47%，血液T790M的發(fā)現(xiàn)比臨床進(jìn)展提前了中位時(shí)間2.2個(gè)月。另外，今年ASCO上一項(xiàng)Rociletinib（Co-1686）治療血漿T790M陽(yáng)性患者療效的研究顯示血液T790M檢測(cè)與組織檢測(cè)一致性達(dá)到81%，具有良好的靈敏度與特異度。血漿T790M陽(yáng)性和陰性患者的ORR為53%、39%，無(wú)論是血漿T790M陽(yáng)性還是組織陽(yáng)性O(shè)RR均為53%，進(jìn)一步驗(yàn)證了血液檢測(cè)的穩(wěn)定性[25]。

專家組推薦：初治患者方面，一般篩選條件是較晚期的，最好Ⅲ期以上，鑒于組織檢測(cè)為金標(biāo)準(zhǔn)，考慮無(wú)組織標(biāo)本情況下再選擇血液檢測(cè)。對(duì)于經(jīng)治患者（或復(fù)發(fā)、PD），由于原先的組織樣本或前期的EGFR檢測(cè)結(jié)果對(duì)經(jīng)治后的腫瘤分子病理狀態(tài)缺少實(shí)時(shí)參考意義，且很難再取標(biāo)本，即可選擇血液檢測(cè)，為患者爭(zhēng)取機(jī)會(huì)。早期患者，由于EGFR豐度低以及考慮現(xiàn)有的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，不推薦血液EGFR檢測(cè)。但在早期監(jiān)測(cè)耐藥突變等臨床研究中，可考慮血液EGFR檢測(cè)。

4 血液EGFR檢測(cè)的樣本收集和DNA提取

全血中血漿和血清均能分離出ctDNA，但通過(guò)和相匹配的血清樣本比較，血漿中EGFR有更高的檢出率[26]。血漿ctDNA通常片段較短，且在血液中濃度通常非常低[27-28]。抽血后延遲血漿分離會(huì)導(dǎo)致血細(xì)胞裂解，釋放出基因組DNA（gDNA）至血漿中；大量增加的gDNA會(huì)稀釋腫瘤來(lái)源的ctDNA，使得突變難以檢出[29]。因此在標(biāo)本的采集、運(yùn)輸及儲(chǔ)存過(guò)程中，防止游離DNA的降解是首要考慮的因素；其次，也應(yīng)防止血液中白細(xì)胞的裂解，避免因野生型DNA背景的增加導(dǎo)致ctDNA中的突變DNA無(wú)法檢測(cè)出。

專家組推薦：為了采集到最佳血漿標(biāo)本用于后續(xù)提取游離DNA及EGFR突變檢測(cè)，建議使用如下兩種方法之一采集10ml全血并進(jìn)一步分離血漿：（1）用含有游離DNA保護(hù)劑及防細(xì)胞裂解保護(hù)劑的專用常溫采血管采集全血后輕搖混勻，常溫（6～30℃）放置不超過(guò)5～7d；以足夠的離心力將全血充分離心2次，從而分離出不含細(xì)胞成分的血漿，放置于-70℃凍存直至DNA抽提，或直接進(jìn)入DNA抽提步驟。（2）建議用常規(guī)EDTA抗凝管（嚴(yán)禁使用肝素抗凝管）采集全血后，2h內(nèi)以足夠的離心力將全血充分低溫離心兩次[29-30]，分離出不含細(xì)胞成分的血漿，放置-70℃凍存直至DNA抽提，或直接進(jìn)入DNA抽提步驟。為保證ctDNA濃度，建議使用10ml全血分離出的血漿（4～5ml）。ctDNA的提取有很多方法，建議采用國(guó)家藥監(jiān)部門(mén)批準(zhǔn)的、大容量血漿游離DNA分離試劑盒。

5 EGFR突變檢測(cè)質(zhì)控及報(bào)告

為保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性與報(bào)告的及時(shí)性，專家組推薦：EGFR基因突變的檢測(cè)須在符合臨床核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)開(kāi)展，進(jìn)行檢測(cè)的操作人員必須是接受過(guò)培訓(xùn)且技能熟練的工作人員，持PCR培訓(xùn)合格證上崗，同時(shí)需要有質(zhì)量控制和質(zhì)量保證人員進(jìn)行質(zhì)控和監(jiān)督，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。為及時(shí)滿足臨床診治需求，建議各分子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室從接收標(biāo)本到發(fā)出報(bào)告周期控制在5個(gè)工作日以內(nèi)。

血液EGFR檢測(cè)的臨床應(yīng)用將會(huì)對(duì)NSCLC臨床診療策略帶來(lái)影響：（1）很多患者無(wú)法檢測(cè)，初期無(wú)法進(jìn)行靶向治療。血液檢測(cè)可以擴(kuò)大受益人群，給患者一個(gè)受益的機(jī)會(huì)。（2）縮短診斷周期：專業(yè)化EGFR分子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，通過(guò)建立高效率的分子檢測(cè)平臺(tái)，優(yōu)化流程，從接收標(biāo)本到發(fā)出報(bào)告周期，建議不超過(guò)5個(gè)工作日，以及時(shí)滿足臨床需求。血液檢測(cè)由于其便捷性，診斷周期或可縮短，利于臨床及時(shí)制定治療方案。（3）NSCLC患者在TKI治療過(guò)程當(dāng)中會(huì)發(fā)生耐藥，不少文獻(xiàn)報(bào)道甚至有多次藥物敏感、耐藥交替出現(xiàn)[31]。檢測(cè)不同時(shí)間的EGFR突變狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)各個(gè)時(shí)期不同的突變狀態(tài)，進(jìn)行藥物靈敏度的預(yù)測(cè)，及時(shí)使用合適的藥物。腫瘤不同時(shí)期、治療的不同階段，利用便捷的血液檢測(cè)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)突變狀態(tài)，調(diào)整治療方案，合適的時(shí)間將合適藥物用在合適的患者身上，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療，意義重大。

6 小結(jié)

液體活檢入選2015年十大突破技術(shù)，腫瘤細(xì)胞在凋亡、壞死過(guò)程中，會(huì)釋放腫瘤DNA至血液中，成為血液用于腫瘤個(gè)體化診斷的理論基礎(chǔ)。血液檢測(cè)用于篩選EGFR-TKI適治患者是重要補(bǔ)充，特別對(duì)于沒(méi)有合適組織標(biāo)本供突變檢測(cè)的患者，可作為組織檢測(cè)的補(bǔ)充[16]；血液檢測(cè)可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤標(biāo)志物變化，特別是耐藥突變的出現(xiàn)[12]；血液檢測(cè)用于晚期NSCLC有望實(shí)現(xiàn)，但對(duì)于早期NSCLC有待檢測(cè)技術(shù)不斷的發(fā)展和進(jìn)步。

對(duì)于ctDNA，基于ARMS平臺(tái)優(yōu)化后的方法已有較為成熟的步驟應(yīng)用于臨床服務(wù)；而具有高靈敏度的數(shù)字PCR方法目前檢測(cè)EGFR突變位點(diǎn)相對(duì)有限（19外顯子缺失，21號(hào)外顯子L858R突變以及20號(hào)外顯子T790M突變）[12-13]。以二代測(cè)序技術(shù)（NGS）為代表的新技術(shù)擴(kuò)展了基因突變檢測(cè)的深度和廣度[14]，但其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用更需要海量數(shù)據(jù)積累。在未來(lái)，期待通過(guò)多元化基因檢測(cè)平臺(tái)及技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，血液EGFR基因突變檢測(cè)可實(shí)現(xiàn)從定性到定量檢測(cè)、從靜態(tài)至動(dòng)態(tài)檢測(cè)、從單基因到多基因、基因組/外顯子組檢測(cè)，從而推動(dòng)NSCLC精準(zhǔn)靶向治療的不斷進(jìn)步。

浙江省非小細(xì)胞肺癌血液EGFR基因突變檢測(cè)專家共識(shí)，是在浙江省抗癌協(xié)會(huì)抗癌藥物專業(yè)委員會(huì)的倡導(dǎo)下，從臨床檢測(cè)的角度出發(fā)，結(jié)合我國(guó)肺癌患者（約占全球1/3）眾多的現(xiàn)狀，綜合最新的研究數(shù)據(jù)和CFDA批準(zhǔn)的藥物和伴隨診斷方法，供臨床實(shí)踐參考。本專家共識(shí)將根據(jù)實(shí)際情況定期更新，期望能為未來(lái)進(jìn)一步優(yōu)化EGFR陽(yáng)性肺癌患者的診斷和治療提供指導(dǎo)。

本版共識(shí)專家組成員（按姓氏排序）：陳恩國(guó)，浙江大學(xué)附屬邵逸夫醫(yī)院呼吸內(nèi)科；鄧清華，杭州市腫瘤醫(yī)院放療科；胡煒，臺(tái)州市中心醫(yī)院放療科；江洪，杭州市第一人民醫(yī)院胸外科；林能明：杭州市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部；盧麗琴，浙江省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科；馬勝林，杭州市第一人民醫(yī)院腫瘤科；潘月龍，杭州市腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科；沈韋羽，寧波醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院胸外科；王利民，杭州市第一人民醫(yī)院呼吸科；王建芳，紹興市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科；謝聰穎，溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放化療科；徐如君，杭州市第一人民醫(yī)院病理科；許頌霄，浙江大學(xué)附屬邵逸夫醫(yī)院病理科；夏冰，杭州市腫瘤醫(yī)院MDT中心；楊新妹，嘉興市第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科；周建英，浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科；張沂平，浙江省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科；趙瓊，浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院肺移植及胸部腫瘤科；張仕蓉，杭州市第一人民醫(yī)院杭州市轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心

執(zhí)筆：張仕蓉（E-mail:shirley4444@gmail.com），馬勝林（E-mail:mashenglin@medmail.com.cn）

[1] LeighlN B,Rekhtman N,Biermann WA,et al.Molecular testing for selection of patients with lung cancer for epidermal growth factor receptor and anaplastic lymphoma kinase tyrosine kinase inhibitors:American Society of Clinical Oncology endorsement of the College of American Pathologists/International Association for the study of lung cancer/association for molecular pathology guideline[J].J Clin Oncol,2014,32(32):3673-3679.

[2] Nakajima T,Yasufuku K,SuzukiM,et al.Assessment of epidermal growth factor receptor mutation by endobronchial ultrasoundguided transbronchial needle aspiration[J].Chest,2007,132(2): 597-602.

[3] Shih J Y,Gow C H,Yu C J,et al.Epidermalgrowth factor receptor mutations in needle biopsy/aspiration samples predict response to gefitinib therapy and survival of patients with advanced nonsmallcelllung cancer[J].Int J Cancer,2006,118(4):963-969.

[4] Douillard J Y,Ostoros G,Cobo M,et al.First-line gefitinib in Caucasian EGFR mutation-positive NSCLC patients:a phase-IV, open-label,single-arm study[J].Br J Cancer,2014,110(1):55-62.

[5] Swaminathan R,Butt A N.Circulating nucleic acids in plasma and serum:recent developments[J].Ann N YAcad Sci,2006,10751-10759.

[6] 白樺,趙軍,王書(shū)航,等.變性高效液相色譜法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者外周血及腫瘤組織表皮生長(zhǎng)因子受體突變[J].中華結(jié)核和呼吸雜志, 2008,31(12):891-896.

[7] Zhao X,Han R B,Zhao J,et al.Comparison of epidermal growth factor receptor mutation statuses in tissue and plasma in stage I-IVnon-small cell lung cancer patients[J].Respiration,2013,85 (2):119-125.

[8] Jing C W,Wang Z,Cao H X,et al.High resolution melting analysis for epidermal growth factor receptor mutations in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and plasma free DNA from non-small cell lung cancer patients[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,14 (11):6619-6623.

[9] Brevet M,Johnson M L,Azzoli C G,et al.Detection of EGFR mutations in plasma DNA from lung cancer patients by mass spectrometry genotyping is predictive of tumor EGFR status and response to EGFR inhibitors[J].Lung Cancer,2011,73(1):96-102.

[10] Yung TK,Chan KC,Mok TS,et al.Single-molecule detection of epidermal growth factor receptor mutations in plasma by microfluidics digital PCR in non-small cell lung cancer patients[J]. Clin Cancer Res,2009,15(6):2076-2084.

[11] 高云,陳嘉昌,朱振宇,等.EGFR基因突變及其檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].分子診斷與治療雜志,2011,3(1):51-57.

[12] Oxnard G R,Paweletz C P,Kuang Y,et al.Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA[J].Clin Cancer Res,2014,20(6):1698-1705.

[13] Zhu G,Ye X,Dong Z,et al.Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR-Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer[J].J MolDiagn,2015,17(3):265-272.

[14] Couraud S,Vaca-Paniagua F,Villar S,et al.Noninvasive diagnosis of actionable mutations by deep sequencing of circulating free DNA in lung cancer from never-smokers:a proof-of-concept study from BioCAST/IFCT-1002[J].Clin Cancer Res,2014, 20(17):4613-4624.

[15] Liu X,Lu Y,Zhu G,et al.The diagnostic accuracy ofpleuraleffusion and plasma samples versus tumour tissue for detection of EGFR mutation in patients with advanced non-small cell lung cancer:comparison of methodologies[J].J Clin Pathol,2013,66 (12):1065-1069.

[16] Douillard J Y,Ostoros G,Cobo M,et al.Gefitinib treatment in EGFR mutated caucasian NSCLC:circulating-free tumor DNA as a surrogate for determination of EGFR status[J].J Thorac Oncol,2014,9(9):1345-1353.

[17] Goto K,Ichinose Y,Ohe Y,et al.Epidermalgrowth factor receptor mutation status in circulating free DNA in serum:from IPASS, a phase IIIstudyofgefitinib orcarboplatin/paclitaxelin non-small celllung cancer[J].J Thorac Oncol,2012,7(1):115-121.

[18] Iressa EMASummary ofProduct Characteristics 2014.

[19] Han B,Tjulandin S,Hagiwara K,et al.Determining the prevalence ofEGFR mutations in Asian and Russian patients(pts)with advanced non-small-celllung cancer(aNSCLC)ofadenocarcinoma(ADC)and non-ADC histology:IGNITE study[J].Ann Oncol,2015,26(suppl1):i29-i30.

[20] Mok T,Wu Y L,Thongprasert S,et al.A randomized placebo-controlled phase III study of intercalated erlotinib with gemcitabine/platinum in first-line advanced non-small cell lung cancer(NSCLC):FASTACT-II[J].ASCO Annual Meeting Proceedings,2012,30(15 suppl):7519.

[21] Bai H,Mao L,Wang H S,et al.Epidermal growth factor receptor mutations in plasma DNA samples predict tumor response in Chinese patients with stages IIIB to IVnon-small-celllung cancer[J].J Clin Oncol,2009,27(16):2653-2659.

[22] Wang S,Han X,Hu X,et al.Clinical significance of pretreatment plasma biomarkers in advanced non-smallcelllung cancer patients[J].Clin Chim Acta,2014,430:63-70.

[23] Bettegowda C,Sausen M,Leary R J,et al.Detection of circulating tumor DNAin early-and late-stage human malignancies[J]. SciTranslMed,2014,6(224):224ra224.

[24] Zheng D,Ye X,Zhang M,et al.Association of plasma EGFR T790M ctDNA status with clinical outcome in advanced NSCLC patients with acquired EGFR-TKI resistance[J].ASCO Annual Meeting Proceedings,2015,33(suppl):8080.

[25] Lecia S,Jonathan W G,Heather A W,et al.Efficacy of rociletinib (CO-1686)in plasma-genotyped T790M-positive non-small cell lung cancer(NSCLC)patients(pts)[J].ASCO Annual Meeting Proceedings,2015,33(suppl):8001.

[26] Vallee A,Marcq M,Bizieux A,et al.Plasma is a better source of tumor-derived circulating cell-free DNA than serum for the detection of EGFR alterations in lung tumor patients[J].Lung Cancer,2013,82(2):373-374.

[27] Maheswaran S,Sequist L V,Nagrath S,et al.Detection of mutations in EGFR in circulating lung-cancer cells[J].N Engl J Med, 2008,359(4):366-377.

[28] Stroun M,Lyautey J,Lederrey C,et al.About the possible origin and mechanism of circulating DNA apoptosis and active DNA release[J].Clin Chim Acta,2001,313(1-2):139-142.

[29] Xue X,Teare MD,Holen I,et al.Optimizing the yield and utility of circulating cell-free DNA from plasma and serum[J].Clin Chim Acta,2009,404(2):100-104.

[30] El Messaoudi S,Rolet F,Mouliere F,et al.Circulating cell free DNA:Preanalytical considerations[J].Clin Chim Acta,2013, 424:222-230.

[31] Oxnard G R,Arcila M E,Chmielecki J,et al.New strategies in overcoming acquired resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in lung cancer[J].Clin Cancer Res,2011,17(17):5530-5537.

2015-11-25）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

馬勝林，杭州市第一人民醫(yī)院，E-mail：mashenglin@ medmail.com.cn