白 晗任獻青

1.河南中醫(yī)藥大學，河南鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南鄭州 450000

基于代謝組學的中醫(yī)證型物質基礎研究進展

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1.河南中醫(yī)藥大學，河南鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南鄭州 450000

中醫(yī)證型是中國傳統(tǒng)醫(yī)學辨證論治的產物，關于中醫(yī)證型的標準化研究是中醫(yī)現代化的標志，相關的物質基礎研究是其重要組成部分。代謝組學是繼基因組學、轉錄組學、蛋白質組學后逐漸興起的學科。以“航拍角度”探測生物體在不同生理病理條件下的下游代謝物質，可準確反映出生物體實時代謝狀態(tài)，與中醫(yī)的整體性、動態(tài)性、即時性更為貼近?；诖x組學的中醫(yī)證型標準化研究擁有廣闊的發(fā)展前景。

代謝組學；中醫(yī)證型；物質基礎；代謝標志物

中醫(yī)證型標準化研究是中醫(yī)現代化的必由之路，包括證型分類標準化和物質基礎研究兩大部分。繼基因組學、轉錄組學、蛋白質組學之后，代謝組學的興起為中醫(yī)證型物質基礎研究提供了新的契機，本文就基于代謝組學的中醫(yī)證型物質基礎研究進行闡述。

1 中醫(yī)證型標準化研究

中醫(yī)“證”是對疾病過程中所處一定階段的病位、病因、病性以及病勢等所作的病理性概括，是機體對體內外各種環(huán)境變化和致病因素作出反應的一種整體功能狀態(tài)，并隨著病程的發(fā)展而發(fā)生相應變化[1]。近年來，研究學者多運用流行病學、循證醫(yī)學、數理統(tǒng)計學方法進行中醫(yī)證型標準化研究，取得了豐富成果。中醫(yī)證型物質基礎領域的研究方興未艾，對于專業(yè)技術手段要求較高?；蚪M學、轉錄組學、蛋白質組學都曾被用于此，但研究方法多以某一種或幾種分子或蛋白質為研究對象，所得結果較為局限、單一，無法突出中醫(yī)證型的整體性、動態(tài)性等特點。

代謝組學時代，發(fā)現微觀物質的聯系相當廣泛，某一物質的改變會導致全盤的變動，這符合現代系統(tǒng)論原理，即任何一種生命現象都是整體層面的復雜生理活動的有機整合[2]。代謝組學技術以機體某一中醫(yī)證型狀態(tài)為橫斷面，全面檢測該狀態(tài)下機體代謝下游的小分子化合物，可為中醫(yī)證型提供明確的物質基礎。

2 代謝組學

2.1 概況

1971年，Devaux等[3]提出代謝輪廓分析技術，但并未廣泛使用；1983年，Nicholson等[4]最早把1H NMR技術用于檢驗血漿、血清中的小分子代謝物；1999年，Nicholson等[5]概括代謝組學定義為，以動物的體液或組織為研究對象，研究生物體對生理病理刺激或基因修飾產生的代謝物質的質和量的動態(tài)變化；2000年，Fiehn等[6]正式提出“代謝組學（metabolomics）”這個名詞。

代謝組學是對代謝路徑最終代謝產物進行分析研究，因其能準確地反映出機體整體的代謝水平狀況，故可更直觀、更客觀地反映出生命活動的本質的過程[7]。因此代謝組學技術也更符合以整體觀念和辨證論治為特色的中醫(yī)學的要求，是中醫(yī)學融入現代系統(tǒng)生物學的重要途徑。

2.2 研究方法

代謝組學主要技術手段是核磁共振（NMR），液-質聯用（LC-MS），氣-質聯用（GC-MS），色譜（HPLC，GC）等。通過單獨或聯合應用這些技術手段，研究者能夠對生物體代謝過程中的各種化合物進行全面和定量分析[8]。通過檢測一系列樣品的譜圖，再結合化學模式識別方法，可以判斷出生物體的病理生理狀態(tài)，基因的功能，藥物的毒性和藥效等，并有可能找出與之相關的生物標志物（biomarker）[9-10]。

2.3 生物樣本采集

因尿液、血清或血漿包含上百種待測物質，獲取途徑也較方便，已成為目前代謝組學研究中最常用的樣本[11]，其他如腦脊液、膽汁、消化液、唾液、精液、羊水等，亦可作為代謝組學研究的樣本。血液樣本反映機體對病理或生理刺激的瞬時信息，評價機體的動態(tài)平衡。尿液標本常包含一段時間內產生的代謝信息，反映機體當前的生理或病理狀態(tài)、生物學年齡，也可預測各種先天不足或外環(huán)境影響的致病率[12]。

2.4 測定方法

代謝組學技術包括核磁共振（NMR）、氣相色譜法（GC）、液相色譜法（LC） 、高效液相色譜法（HPLC） 和質譜法（MS）[13]等單分析技術及液相色譜-質譜聯用（LC-MS）和氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）[14]等多分析技術，其中以色譜-質譜聯用、NMR 技術最為常用。

2.5 數據分析

基于代謝組學的數據分析方法有主成分分析法（PCA）、偏最小二乘法-判定分析（PLS-DA）、人工神經元網絡（ANN）、聚類分析（NLM）等模式識別技術[15]，其中以PCA和PLS-DA最為常用。PCA是常用的非監(jiān)督性模式識別方法，可實現數據降維的目的，利于了解數據整體情況；PLS-DA 是基于偏最小二乘法（PLS）線性回歸的統(tǒng)計分析方法，屬于有監(jiān)督模式識別方法，常適用于樣本量少、變量多、變量之間有相關性以及存在噪音變量干擾等情況。相對于 PCA 所得到的得分圖，PLS-DA 可以獲得更好的分類效果[16]。

3 代謝組學在中醫(yī)證型物質基礎研究中的應用

3.1 心血瘀阻證

簡維雄等[17]采用GC-MS對冠心?。–HD）心血瘀阻證和非心血瘀阻證患者的血漿進行檢測，并進行多元統(tǒng)計數據分析，發(fā)現花生四烯酸、乳酸、硬脂酸、尿素等9種代謝物為CHD心血瘀阻證患者的血漿代謝產物譜。其課題組之后進行了對應的動物造模方法研究[18]，采用結扎大鼠冠狀動脈左前降支復制急性心肌梗死（ AMI） 心血瘀阻證模型，運用 GC-MS 檢測方法，并對代謝產物進行主成分分析、偏最小二乘法分析，發(fā)現大鼠 AMI 心血瘀阻證與心肌組織代謝產物蘋果酸、谷氨酸、甘氨酸、葡萄糖、延胡索酸等含量的改變密切相關。課題組[19]又使用KEGG數據庫對相關代謝物代謝通路進行檢索和構建，并對代謝產物分子注釋、相關的酶或轉運蛋白行檢索，進行代謝產物路徑分析，發(fā)現冠心病心血瘀阻證患者中“半乳糖代謝”“酮體的合成和降解通路”發(fā)生變化參與其病理過程。

3.2 熱傷腎絡證

耿雨作[20]選擇符合條件的紫癜性腎炎熱傷腎絡證、非熱傷腎絡證患兒各9例，健康患兒22例，運用代謝組學技術，以尿液為研究對象，初步得出兒童紫癜性腎炎熱傷腎絡證的特異性代謝產物可能是丙酸、醛固酮、均聚L-精氨酸、維生素K2、鈍葉素葡萄糖苷、S-氨甲基二氫硫、苯丙精氨酸、L-蛋氨酸、同型半胱氨酸硫內酯、羥基絡醇4-硫酸醋、精氨酰絲氨酸、雌酮、色氨酰蛋氨酸。

3.3 肺氣虛證

劉志剛等[21]將56只大鼠隨機分為對照組和模型組，模型組建造肺氣虛型COPD大鼠模型，并與對照組相比較，采用HPLC-MS/MS檢測方法檢測血漿代謝物，對數據進行多元統(tǒng)計分析后發(fā)現精胺、雙氫神經酰胺、十二烷二酰肉堿等10種代謝物為COPD肺氣虛證可能的疾病標記物。

3.4 氣虛血瘀證

朱明丹等[22]選擇當地醫(yī)院符合心肌梗死恢復期氣虛血瘀證納入標準的患者為研究對象，年齡40～70歲， 共30例，空腹采集靜脈血標本，離心后取上清液，進行代謝組學特征譜的研究，發(fā)現心肌梗死恢復期氣虛血瘀證較健康對照組溶血磷脂酰膽堿，亞油酸、花生四烯酸、鞘氨醇類物質的代謝水平均下調。

3.5 脾氣虛證與脾陽虛證

王穎等[23]以多因素復合的方法建立脾氣虛、脾陽虛大鼠模型，以1H NMR技術對大鼠進行血漿代謝組學檢測，分別采用弛豫編輯（CPMG）和擴散編輯（LED）脈沖序列對代謝物進行觀察，發(fā)現脾氣虛證的可能代謝物有：葡萄糖、乳酸、丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、脂類等12種；脾陽虛證可能代謝物有：葡萄糖、乳酸、丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺等13種，該二證型主要存在能量代謝、脂代謝和糖代謝等異常。

3.6 先天伏寒證

魏巖等[16]發(fā)現利用代謝組學方法能夠確定冠心病心絞痛患者先天伏寒證與非先天伏寒證間存在著明顯的差異性代謝產物，高密度脂蛋白、丙氨酸、乳酸、低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α-葡萄糖、β-葡萄糖、N-乙酰糖蛋白、脂類化合物有可能成為冠心病先天伏寒證的潛在生物標記物。

3.7 痰濁證與血瘀證

張紅栓等[24]選擇符合納入標準的冠心病心絞痛痰濁痹阻證（痰濁證）， 心血瘀阻證（血瘀證）患者各10例，對其血漿樣本進行H NMR檢測，用主成分分析與偏最小二乘判別分析處理圖譜數據，發(fā)現痰濁證組乳酸、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白等12種代謝物含量高于血瘀證組；反之，血瘀證組丙氨酸、高密度脂蛋白、不飽和脂肪酸等7種代謝物含量高于痰濁證組。

3.8 痰濁證與氣虛證

程鵬等[25]選取冠心病患者65例（痰凝心脈證37 例，心氣虛弱證28 例），應用GC /MS技術測定兩種證型患者的血清內源性代謝物，并分析其代謝譜之間的差異，最終得到準確定性的化合物 46 個，對鑒別這兩種證型貢獻值最大的化合物為絲氨酸，其次為纈氨酸、2-羥基丙酸等。對兩種證型代謝物量進行比較，發(fā)現痰濁證絲氨酸、2-羥基丙酸顯著高于氣虛證組（P＜0.05）。

3.9 脾氣虛證與脾胃濕熱證

施旭光等[26]選擇慢性淺表性胃炎脾氣虛證、脾胃濕熱證患者各10例，健康志愿者10例 ，對其尿液進行H-NMR檢測，并采用多元統(tǒng)計數據分析，在脾氣虛證患者和健康志愿者尿液中共篩選得到谷氨酸、甲硫氨酸、α-酮戊二酸、二甲基甘氨酸、肌酐、?；撬峒捌咸烟?種差異代謝產物；在脾胃濕熱證患者和健康志愿者尿液中篩選得到2-羥基丁酸、氧化三甲胺、?；撬?、馬尿酸4種差異代謝產物；在脾氣虛證和脾胃濕熱證患者中篩選得到巖藻糖、β-羥基丁酸等11種差異代謝產物。

4 問題與展望

（1）代謝組學技術應用于中醫(yī)證型研究尚未成熟，關于代謝組學的試驗操作標準、液相、氣相及質譜條件標準和數據分析等，仍有待確立相應的技術標準[27]；（2）國內目前基于代謝組學的中醫(yī)證型研究多以動物造模為研究對象，缺乏臨床病例的大樣本量研究。由于中醫(yī)證候的多樣性、復雜性和易變性，動物模型無法完全模擬人體代謝狀態(tài)，也不可忽略動物模型與人體存在的差別[28]。（3）中醫(yī)證型分類以臨床表現為基礎，可見主證和標證，不同癥候間相互兼夾，對其物質基礎分析會有一定影響，這也導致了研究結果的重復性較低[29]； 但相較于基因組學、蛋白質組學和轉錄組學等技術，代謝組學有其不可忽略的優(yōu)勢，其整體性、動態(tài)性的研究方法，與中醫(yī)證型有異曲同工之妙，已成為現今中醫(yī)證型物質基礎研究不可替代的技術手段。

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Research progress on material basis of TCM Syndrome based on metabonomics

BAI Han1REN Xianqing2
1.Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China; 2.The First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China

TCM Syndrome Types is the product of traditional Chinese medicine syndrome differentiation and treatment. Research on standardization of TCM syndrome type is the symbol of modernization of traditional Chinese Medicine. The research of related material basis is an important part. Metabonomics is a subject that has been developed gradually after genomics, proteomics and proteomics. investigation of the downstream metabolites of organisms under different physiological and pathological conditions under “Aerial view” accurately reflect the metabolism of organisms in real time. It is more closer to the integrity, dynamics, immediacy of Chinese medicine. Study on standardization of TCM Syndrome Types based on metabonomics has broad prospects for development.

Metabonomics; TCM Syndrome; Material basis; Metabolic marker

R223

A

2095-0616（2016）21-52-04

2016-09-08）

▲通訊作者