王召平，朱姮，王曉，耿巖玲，仙云霞，于金倩*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省科學(xué)院中藥過程控制研究中心，山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014)

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核磁共振內(nèi)標(biāo)法測定乙基麥芽酚對(duì)照品的含量

王召平1，朱姮1，王曉2，耿巖玲2，仙云霞1，于金倩2*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省科學(xué)院中藥過程控制研究中心，山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014)

摘要：建立了用核磁共振內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確、快速測定乙基麥芽酚對(duì)照品含量的方法。采用Varian Inova 600 MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀，以氘代DMSO-d6為溶劑、苯甲酸為內(nèi)標(biāo)，在25 ℃條件下采集乙基麥芽酚和苯甲酸混合物的核磁共振氫譜。以乙基麥芽酚中化學(xué)位移在δH6.34和苯甲酸中化學(xué)位移在δH7.95的質(zhì)子信號(hào)峰為定量峰，其峰面積y(As/Ar)與其質(zhì)量比x(ms/mr)的線性回歸方程為y = 0.805 8x+0.087 3，相關(guān)系數(shù)R=0.999 0。測得3批乙基麥芽酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為99.47%，99.34%和99.51%。在沒有對(duì)照品的情況下，核磁共振內(nèi)標(biāo)法可用于乙基麥芽酚對(duì)照品的含量測定和質(zhì)量控制,同時(shí)可作為一種在沒有對(duì)照品的情況下化合物含量測定的有效方法，為測定其他化學(xué)對(duì)照品的含量提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：核磁共振；乙基麥芽酚；含量

Content determination of 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone

乙基麥芽酚(2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone)是一種安全無毒、用途廣、效果好且用量少的理想食品添加劑，增香效果是甲基麥芽酚的6倍，24份香豆素相當(dāng)于1份乙基麥芽酚[1]。1970年,世界衛(wèi)生組織及聯(lián)合國糧農(nóng)組織已經(jīng)確認(rèn)乙基麥芽酚為食品添加劑[2]。我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》GB12487-2010[3]也確認(rèn)其可作為食品合成香料使用。乙基麥芽酚現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、飲料、牙膏、香煙和藥品，是一種安全性高、無毒、增香、增甜、保香和掩蓋異味的常用食品添加劑?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，乙基麥芽酚可以控制人體鐵和鋁的含量水平[4]，在抑制人體過氧化物、抗衰老方面也有一定效果[5]。目前乙基麥芽酚測量方法有高效液相色譜法、反相高效液相色譜法、電化學(xué)法、熒光法和氣相色譜法等[6-11]。這些分析測試方法有的操作繁瑣，有的靈敏度不高，存在準(zhǔn)確性、可比性和溯源性不是很好的缺陷，并且各種測量方法均需要與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照。

目前，定量核磁共振技術(shù)(QNMR)廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物、食品、農(nóng)業(yè)及軍事等領(lǐng)域[12]，在醫(yī)藥領(lǐng)域用于對(duì)化學(xué)藥品、體液樣品、中藥與植物提取物等的定量分析[13-16]。QNMR技術(shù)在化合物純度定值、含量測定方面具有準(zhǔn)確度高、靈敏度高、分析速度快以及樣品用量少的特點(diǎn)，適合于樣品的含量測定。核磁共振定量分析法先后被美國藥典、英國藥典以及歐洲藥典作為某些藥品的標(biāo)準(zhǔn)測量方法收錄[17-19]，中國藥典也在2010版收錄了該方法[20]。但目前沒有運(yùn)用QNMR技術(shù)對(duì)乙基麥芽酚含量測定的相關(guān)報(bào)道。本研究采用核磁共振內(nèi)標(biāo)法測定了乙基麥芽酚對(duì)照品的含量，建立了在無需使用對(duì)照品的情況下對(duì)乙基麥芽酚進(jìn)行質(zhì)量控制和含量測定的方法。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器

Inova 600 MHz核磁共振波譜儀(美國Varian公司)。

1.2試劑與樣品

氘代二甲亞砜(99.9%氘代，美國CIL公司)，苯甲酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%，批號(hào)101253928，美國Sigma 公司)，乙基麥芽酚對(duì)照品。乙基麥芽酚和苯甲酸的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1　乙基麥芽酚和苯甲酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1　Chemical structures of 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone and benzoic acid

1.3核磁共振采集條件

測定溫度：25 ℃，環(huán)境濕度：35%，譜寬：15 000.9 Hz，F(xiàn)T size：131 072，累加次數(shù)：64，采集時(shí)間：6 s，觀察頻率：600 MHz。

1.4方法

乙基麥芽酚對(duì)照品和苯甲酸對(duì)照品精密稱取適量，分別放置在核磁共振樣品管中(d=5 mm)，加入氘代試劑適量(二甲亞砜)，振搖使樣品完全溶解，即得樣品溶液。在1.3的核磁共振采集條件下，調(diào)整參數(shù)，然后進(jìn)行勻場、核磁數(shù)據(jù)采集，測得樣品核磁共振氫譜。分別對(duì)乙基麥芽酚和苯甲酸的定量峰進(jìn)行積分，運(yùn)用以下公式對(duì)樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行計(jì)算

其中，As：乙基麥芽酚峰面積積分值，Ar：苯甲酸峰面積積分值，ns：乙基麥芽酚定量峰包含的質(zhì)子數(shù)，nr：苯甲酸定量峰包含的質(zhì)子數(shù)，ms：乙基麥芽酚的質(zhì)量，mr：苯甲酸的質(zhì)量，Wr：苯甲酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，Ms：乙基麥芽酚分子質(zhì)量，Mr：苯甲酸的分子質(zhì)量。

2結(jié)果與討論

2.1內(nèi)標(biāo)物、氘代試劑和特征性定量峰的選擇

核磁共振內(nèi)標(biāo)法在內(nèi)標(biāo)物選擇上要保證不干擾被測物質(zhì)的信號(hào)峰，本研究選擇苯甲酸為核磁定量內(nèi)標(biāo)物。苯甲酸的核磁共振氫譜顯示，其2位和6位質(zhì)子信號(hào)為δH7.95，可以與其他氫信號(hào)完全分開[21]。測試溶劑的選擇也至關(guān)重要，既要保證被測物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)物在溶劑中溶解性好，又要確定氘代溶劑對(duì)測定結(jié)果不能造成干擾。本次研究選用氘代二甲亞砜為測試溶劑，氘代二甲亞砜對(duì)乙基麥芽酚和苯甲酸溶解性都非常好，并且氘代二甲亞砜在核磁共振氫譜上溶劑峰為δH2.49，對(duì)乙基麥芽酚與苯甲酸的信號(hào)峰沒有干擾，不會(huì)影響含量測定結(jié)果。

在核磁共振內(nèi)標(biāo)法定量分析之前，已通過核磁共振一維譜和二維譜對(duì)乙基麥芽酚的信號(hào)峰進(jìn)行了逐一歸屬；在乙基麥芽酚的核磁共振氫譜上可以看到5位的質(zhì)子信號(hào)化學(xué)位移為δH6.34[21]，與其他核磁氫信號(hào)完全分開，可作為乙基麥芽酚定量分析的特征峰。核磁共振內(nèi)標(biāo)法測定乙基麥芽酚含量的氫譜如圖2所示。

圖2　核磁共振內(nèi)標(biāo)法測定乙基麥芽酚含量的氫譜Fig.2　1H-NMR spectrum of QNMR determined 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone

2.2線性關(guān)系

按照1.4實(shí)驗(yàn)方法，配置6種不同濃度的待測樣品溶液，依照1.3的核磁共振采集條件，測定每種濃度樣品的核磁共振氫譜，并分別對(duì)乙基麥芽酚和苯甲酸特征信號(hào)峰的峰面積進(jìn)行積分，每個(gè)樣品積分3次，取3次積分的平均值作為乙基麥芽酚的積分面積，具體結(jié)果如表1所示。

表1　乙基麥芽酚和苯甲酸的質(zhì)量及氫譜峰面積積分值

注：ms為乙基麥芽酚質(zhì)量，mr為苯甲酸的質(zhì)量，As為乙基麥芽酚峰面積積分值，Ar為苯甲酸峰面積積分值。

將x作為乙基麥芽酚與苯甲酸質(zhì)量的比值，y作為乙基麥芽酚與苯甲酸的積分面積的比值，進(jìn)行線性關(guān)系計(jì)算，求得線性回歸方程：y= 0.805 8x+0.087 3(R= 0.999 0，n=6)。計(jì)算結(jié)果表明，所建立的以苯甲酸為內(nèi)標(biāo)物測定乙基麥芽酚含量的方法，線性關(guān)系良好。

2.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

抽取表1中的5號(hào)樣品，放置在室溫下，按照上述1.4的實(shí)驗(yàn)方法，分別在0、4、8、12、16 h后測定，對(duì)乙基麥芽酚進(jìn)行穩(wěn)定性測試，計(jì)算得出RSD為0.66%。實(shí)驗(yàn)說明該樣品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

抽取表1中的5號(hào)樣品，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下按照1.4的實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)測定6次，以乙基麥芽酚與苯甲酸定量特征峰的積分面積比值進(jìn)行計(jì)算，得出RSD為0.32%。結(jié)果說明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

2.5采樣次數(shù)的選擇

增加樣品的采樣次數(shù)，可以提高信號(hào)性噪比，樣品峰的積分?jǐn)?shù)據(jù)更加穩(wěn)定。本次實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置采樣次數(shù)為4、8、16、32、64、128，對(duì)樣品分別進(jìn)行掃描測試。通過實(shí)驗(yàn)得出，采樣次數(shù)的增大對(duì)乙基麥芽酚和苯甲酸積分面積的比值基本沒有影響，而且增加了樣品分析時(shí)間，64次采樣次數(shù)足以滿足本實(shí)驗(yàn)對(duì)精密度的要求，故設(shè)置采樣次數(shù)為64。

2.6加樣回收率實(shí)驗(yàn)

分別精密稱取乙基麥芽酚樣品4、5、6 mg各2份，精密稱取乙基麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)品6、5、4 mg各2份，并將標(biāo)準(zhǔn)品分別加入到乙基麥芽酚樣品中，依照1.4的實(shí)驗(yàn)方法依次測定待測樣品的核磁共振氫譜，依據(jù)回收率公式：回收率(%)= [測得含量-樣品含量]/標(biāo)準(zhǔn)品添加量[22]，計(jì)算得出乙基麥芽酚的樣品回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2　加樣回收率測試結(jié)果(n=6)

2.7樣品測定

取3個(gè)批次的乙基麥芽酚對(duì)照品，采用HPLC法測定其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，同時(shí)依照上述1.3實(shí)驗(yàn)條件和1.4實(shí)驗(yàn)方法，測定上述3個(gè)批次乙基麥芽酚對(duì)照品與苯甲酸特征峰的峰面積，按照1.4的計(jì)算公式計(jì)算，可得乙基麥芽酚對(duì)照品的絕對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，測定結(jié)果如表3所示。通過表3數(shù)據(jù)對(duì)比可得出，運(yùn)用高效液相歸一化法得到的乙基麥芽酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)略高于核磁共振內(nèi)標(biāo)法，主要是由于核磁共振內(nèi)核法測定時(shí)去除了乙基麥芽酚的吸收水分，只測定了絕對(duì)含量[22]。

表3　測定乙基麥芽酚對(duì)照品含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%)

3結(jié)論

上述實(shí)驗(yàn)采用磁共振內(nèi)核方法，以氘代DMSO為溶劑，苯甲酸為內(nèi)標(biāo)物，建立測定乙基麥芽酚對(duì)照品含量的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用磁共振內(nèi)核方法對(duì)乙基麥芽酚含量進(jìn)行測定，線性關(guān)系、重復(fù)性和穩(wěn)定性均良好。此方法具有原子核吸收共振面積只與原子數(shù)目有關(guān)、不受外界環(huán)境影響、測量時(shí)無需使用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照、無需引入校正因子、樣品使用量少、適用范圍廣、操作簡單、分析速度快，含量測定和結(jié)構(gòu)鑒定可同步完成的特點(diǎn)，與傳統(tǒng)的測量方法相比，具有較大的優(yōu)勢(shì)。因此，磁共振內(nèi)核法可以作為對(duì)照品含量測定的一種新方法，廣泛運(yùn)用于其他化學(xué)對(duì)照品含量的測定。

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【中藥與天然活性產(chǎn)物】

reference with1H-NMR spectroscopy

WANG Zhao-ping1,ZHU Heng1,WANG Xiao2,GENG Yan-ling2,

XIAN Yun-xia1,YU Jin-qian2*

(1.Shangdong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355,China;2.Process Control Research

Center of Traditional Chinese Medicine, Shandong Analysis and Test Center, Jinan 250014, China)

Abstract∶We established a rapid and accurate method to determine the content of 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone reference by quantitative nuclear magnetic resonance.We acquired1H-NMR spectra of 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone and benzoic acid mixture at 25 ℃ with Varian Inova 600 MHz spectrometer, DMSO-d6as solution, and benzoic acid as internal standard.We determined the contents of 3 batches of 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone were 99.47%, 99.34% and 99.51% with proton signals at δH6.34 of 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone and δH7.95 of benzoic acid as quantification peaks, whose linear regression equation of peak areas ratio y(As/Ar) and mass ratio x(ms/mr) was y = 0.8058x+0.0873 and correlation coefficient was 0.999 0.The method can be applied to content determination and quality control of 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone reference without any references.It can also provide references for content determination of other substances.

Key words∶QNMR; 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone;content

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2015.04.007

中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-4026(2015)04-0030-05

通訊作者*,于金倩(1987-)，女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物提取分離及標(biāo)準(zhǔn)樣品制備。Email:yujinqian87528@126.com

作者簡介：王召平(1988-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物分離與純化。

基金項(xiàng)目：山東省分析測試中心所 (CS201305)

收稿日期：2015-05-15