蔣志瓊，鐘澤民，譚博敏，余希堯，黃毓茂(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642)

丹毒絲菌SpaA基因免疫保護(hù)區(qū)的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)

蔣志瓊，鐘澤民，譚博敏，余希堯，黃毓茂
(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642)

摘要:【目的】以畢赤酵母Pichia pastoris X-33為宿主表達(dá)豬丹毒絲菌Erysipelothrix rhusiopathiae SpaA基因氨基端的免疫保護(hù)區(qū)蛋白.【方法】以采集于廣東某豬場(chǎng)的豬丹毒絲菌為模板，根據(jù)NCBI中已發(fā)表的Spa基因cDNA序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到SpaA-N，并將其連接到表達(dá)載體pPICZαC上，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαC-SpaA-N; 用Sac I酶將重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαC-SpaA-N線性化后電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母X-33，經(jīng)含博來(lái)霉素ZencinTM抗性的YPDS平板篩選和PCR鑒定的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，用含不同濃度博來(lái)霉素抗性的YPDS平板篩選出高拷貝子并進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別于誘導(dǎo)48、72、96 h后離心收集上清液，立即做SDS-PAGE，并進(jìn)行SDS-PAGE及Western-blot試驗(yàn).【結(jié)果和結(jié)論】成功克隆并表達(dá)了SpaA-N基因，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαC-SpaA-N，并以畢赤酵母X-33為宿主成功表達(dá)了豬丹毒絲菌SpaA基因氨基端的免疫保護(hù)區(qū)蛋白.丹毒絲菌SpaA-N作為免疫保護(hù)區(qū)在酵母宿主中得以成功表達(dá).

關(guān)鍵詞:丹毒絲菌; SpaA基因;畢赤酵母;克隆和表達(dá);亞單位疫苗

蔣志瓊，鐘澤民，譚博敏，等.丹毒絲菌SpaA基因免疫保護(hù)區(qū)的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36(3) : 20-25.

優(yōu)先出版時(shí)間:2015-04-14

優(yōu)先出版網(wǎng)址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20150414.0925.002.html

丹毒絲菌Erysipelothrix rhusiopathiae屬于丹毒絲菌屬，是一種兼性厭氧、無(wú)芽孢、不產(chǎn)酸的纖小革蘭陽(yáng)性桿菌［1］，是引起豬丹毒和人類(lèi)丹毒癥的病原體［2］.該菌能夠在各種環(huán)境中長(zhǎng)期存在(包括海中)［3］，并且能夠感染各種野生動(dòng)物和家畜、鳥(niǎo)類(lèi)和魚(yú)類(lèi)［4-8］，從而引發(fā)疾病(魚(yú)除外)，該病在全球廣泛存在，呈散發(fā)或流行性發(fā)生，特別是能夠引起豬的急性熱性敗血癥、亞急性疹塊、慢性關(guān)節(jié)炎和心內(nèi)膜炎，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失［9］.目前國(guó)內(nèi)豬丹毒病仍時(shí)有發(fā)生［10-14］，雖然感染陽(yáng)性率不高，但是豬丹毒的陽(yáng)性檢出率卻比較高［15］，因此豬丹毒的隱性感染值得關(guān)注.目前，常用防治豬丹毒的方法還是傳統(tǒng)疫苗，雖然此類(lèi)疫苗在一定程度上起到了相應(yīng)的作用，但對(duì)慢性豬丹毒的作用效果并不強(qiáng)，而且還在很大程度上增加了豬慢性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率［16-17］，因此研究一種新型豬丹毒疫苗迫在眉睫.

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)豬丹毒免疫保護(hù)性蛋白(rSpa)進(jìn)行了大量的研究，為豬丹毒的診斷和防治提供了科學(xué)的理論依據(jù).其中表面保護(hù)抗原A (SpaA)由N端的免疫保護(hù)性區(qū)域和C端的細(xì)胞結(jié)合區(qū)域組成，大量研究表明其具有良好的免疫保護(hù)功能［8，18-20］.而SpaA蛋白中起主要免疫保護(hù)效應(yīng)的核心區(qū)段為氨基端(SpaA-N)，其免疫保護(hù)作用受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，并進(jìn)行了大量的試驗(yàn)研究［21-25］.研究者們利用原核表達(dá)技術(shù)成功地克隆出Spa-N片段基因序列，并且研究了其免疫功能［23，25］.

本試驗(yàn)成功地?cái)U(kuò)增了Spa-N基因序列，并利用酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行表達(dá)，為Spa-N作為一種亞單位疫苗投入生產(chǎn)時(shí)的高產(chǎn)量、生長(zhǎng)快速、易操作和低成本提供了理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和載體豬丹毒菌分離自廣東某豬場(chǎng)，pPICZαC為Invitrogen公司產(chǎn)品，大腸埃希菌Escherichia coli DH5α為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品，畢赤酵母Pichia pastoris X-33由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病教研室保存.

1.1.2試劑與酶類(lèi)質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、純化試劑盒等為Omega公司產(chǎn)品;各限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DNA聚合酶、DNA Marker等為T(mén)aKa-Ra公司產(chǎn)品; PCR引物合成及測(cè)序由Invitrogen公司完成;博萊霉素、D-生物素、酵母氮堿等為Sigma公司產(chǎn)品;培養(yǎng)基成分如蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、培養(yǎng)基以及SDS-PAGE試驗(yàn)所需試劑、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG等均為北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司產(chǎn)品;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.1.3培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基: 10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，雙蒸水定容至1 L.固體LB培養(yǎng)基:在液體LB培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加1.5%瓊脂粉.血清瓊脂培養(yǎng)基:在普通LB培養(yǎng)基的配方基礎(chǔ)上，雙蒸水定容至90 mL后混勻高壓，待冷卻至一定溫度時(shí)加入10%的兔血清.YPD培養(yǎng)基:酵母提取物10 g，胰蛋白胨20 g，溶于900 mL雙蒸水中，高壓滅菌20 min，再加入100 mL已過(guò)濾0.2 g·mL－1的D-葡萄糖.YPDS培養(yǎng)基:酵母提取物10 g，胰蛋白胨20 g，山梨醇182.2 g，雙蒸水定容至900 mL，高壓20 min后加入100 mL已滅菌的0.2 g·mL－1的D-葡萄糖.BMGY培養(yǎng)基:酵母提取物10 g、胰蛋白胨20 g溶于700 mL雙蒸水中，高壓滅菌后冷卻至室溫，分別加入100 mL已除菌的1 mol·L－1磷酸緩沖液(pH6.0)、134 g·L－1酵母氮堿、體積分?jǐn)?shù)為10%的丙三醇及20 mg·L－1的生物素2 mL.BMMY培養(yǎng)基:酵母提取物10 g，胰蛋白胨20 g，溶于700 mL雙蒸水中，高壓滅菌后冷卻至室溫，分別加入100 mL已除菌的1 mol·L－1磷酸緩沖液(pH6.0)、134 g·L－1酵母氮堿、體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醇10 mL及20 mg·L－1的生物素2 mL.

1.2重組畢赤酵母表達(dá)載體的建立

1.2.1引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)NCBI上SpaA序列，登錄號(hào): AB259654.1，運(yùn)用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物用于擴(kuò)增SpaA-N.上游引物P1加入Xho I酶切位點(diǎn);下游引物P2加入Xba I酶切位點(diǎn)和終止密碼子.本試驗(yàn)預(yù)采用畢赤酵母表達(dá)載體的α因子信號(hào)肽，由于質(zhì)粒pPICZαC雙酶切中會(huì)丟失KEX2蛋白酶的酶切位點(diǎn)Lys-Arg，因此在設(shè)計(jì)上游引物的時(shí)候，還加入了編碼Lys-Arg的密碼子AAAAGA.引物由Invitrogen公司合成.引物序列:上游引物P1，5'- CCCTCGAGAAAAGAGGGTACCAAAGTTTCGAAGC-3';下游引物P2，5'-GC TCTAGATTAGATCTTTAGGTTTTTCTTCATCAA-3'.

1.2.2丹毒絲菌SpaA-N的PCR擴(kuò)增利用煮－凍－煮法裂解豬丹毒絲菌的細(xì)胞壁，進(jìn)行菌落PCR.PCR反應(yīng)體系: Ex 10×PCR Buffer 2 μL，2.5 mmol dNTP Mixture 2 μL，引物P1、P2各0.5 μL，Ex Taq DNA聚合酶0.125 μL，ddH2O 17.375 μL，模板2 μL.反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸70 s，30個(gè)循環(huán); 72℃終延伸10 min.經(jīng)8 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物后，利用DNA回收試劑盒進(jìn)行純化回收.

1.2.3重組表達(dá)載體的構(gòu)建對(duì)膠回收后的回收產(chǎn)物Spa-N和表達(dá)載體pPICZαC同時(shí)進(jìn)行Xho I和Xba I雙酶切，并利用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收.將酶切回收后的目的基因與表達(dá)載體連接后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將最后一步的重懸液均勻涂布于含ZencinTM(25 μg·mL－1)的低鹽LB固體培養(yǎng)基上，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h.

1.2.4重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定PCR鑒定:挑選低鹽LB平板上的可疑菌落于含ZencinTM(100 μg·mL－1) LB液體培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)8 h，做菌液PCR鑒定.PCR體系與反應(yīng)條件同“1.2.2”.

單酶切和雙酶切鑒定:按照相應(yīng)體系，利用酶Xho I與Xba I進(jìn)行雙酶切鑒定，用酶Xba I進(jìn)行單酶切鑒定.

1.3 SpaA-N基因在畢赤酵母中的表達(dá)

1.3.1畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞的制備參照Invitrogen EasySelect Pichia Expression kit介紹的方法進(jìn)行制備.1.3.2重組質(zhì)粒pPICZαC-SpaA-N的電擊轉(zhuǎn)化根據(jù)Invitrogen公司實(shí)驗(yàn)手冊(cè)進(jìn)行.先利用Sac I單酶切重組質(zhì)粒pPICZαC-SpaA-N，使之線性化，同時(shí)對(duì)空質(zhì)粒pPICZαC也進(jìn)行同酶同系線性化，反應(yīng)體系(50 μL) : 10×Buffer 5 μL，pPICZαC-SpaA-N 30 μL，Sac I 3 μL，ddH2O 12 μL.將75 μL新制備的感受態(tài)酵母細(xì)胞與25 μL線性化的重組質(zhì)粒輕輕混勻后轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中冰浴5 min.設(shè)定電轉(zhuǎn)參數(shù)305 V，進(jìn)行15 ms電轉(zhuǎn)后立即加入1 mL預(yù)冷的1 mol·L－1山梨醇，混勻后轉(zhuǎn)入5 mL離心管，30℃條件下靜置1～2 h，再加入YPD液體培養(yǎng)基1 mL，30℃震蕩培養(yǎng)1 h.4 000 r·min－1收集菌體，用50～200 μL YPD重懸菌體后鋪于新鮮制備的YPDS平板(含ZencinTM100 μg·mL－1)上，將平板倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d.

1.3.3重組酵母菌菌液PCR鑒定及高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選挑取單菌落于1 mL YPDS培養(yǎng)基中(含ZencinTM200 μg·mL－1)擴(kuò)菌培養(yǎng)，采用煮－凍－煮法制備PCR模板分析畢赤酵母轉(zhuǎn)化子，以P1、P2為引物擴(kuò)增出1 029 bp的片段為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子.PCR體系與反應(yīng)條件同“1.2.2”.再經(jīng)不同濃度ZencinTM的YPDS平板篩選高拷貝克隆工程菌，用于高效誘導(dǎo)表達(dá)SpaA-N蛋白.

1.3.4抗血清的制備購(gòu)買(mǎi)8只體質(zhì)量都在15 g左右的SPF雌鼠.培養(yǎng)豬丹毒菌，用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，并用生理鹽水將其稀釋至10 LD50(1.1×102cfu)，加入體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲醛進(jìn)行滅菌處理，劃板驗(yàn)證為無(wú)菌后進(jìn)行下一步試驗(yàn).將鋁膠佐劑與經(jīng)過(guò)滅菌處理的豬丹毒菌液按照體積比1∶5的比例進(jìn)行混合，第1次免疫時(shí)每只小鼠腹腔注射100 μL混合液，14 d后進(jìn)行第2次免疫，第2次免疫10 d后進(jìn)行第3次免疫，3次注射劑量均相同，在第3次免疫10 d后進(jìn)行摘眼取血.采集的血液先置37℃條件下凝固約2 h，然后置4℃條件下過(guò)夜，使血塊收縮，第2天5 000 r·min－1離心5 min，收集血清，于－80℃條件保存?zhèn)溆?

1.3.5高拷貝酵母工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE

挑取陽(yáng)性單克隆轉(zhuǎn)化子，接種至BMGY中，28℃搖至D600 nm為2～6，用BMMY重懸細(xì)胞至D600 nm為1.0進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每24 h加甲醇至甲醛終體積分?jǐn)?shù)為1%以繼續(xù)誘導(dǎo).分別在48、72、96 h時(shí)離心收集上清液，立即做SDS-PAGE或－20℃條件保存?zhèn)溆?，并做SDS-PAGE及Western-blot分析.

1.3.6免疫及動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)將16只體質(zhì)量為18～20 g的昆明小鼠隨機(jī)分為2組，每組8只.將生理鹽水、經(jīng)過(guò)畢赤酵母表達(dá)的SpaA-N蛋白分別與鋁膠佐劑以體積比5∶1進(jìn)行混合，每只小鼠腹腔注射混合液100 μL進(jìn)行第1次免疫，分別命名為組1、組2，其中組1為空白對(duì)照組.第1次免疫14 d后進(jìn)行第2次免疫，各組的免疫劑量與方法同第1次免疫.分別對(duì)第2次免疫14 d后的2組免疫小鼠進(jìn)行腹腔注射攻毒，攻毒劑量為100 LD50(1.1×103cfu)，連續(xù)觀察10 d，記錄各組小鼠死亡數(shù)，計(jì)算各免疫組的保護(hù)率.

2　結(jié)果

2.1 Spa-N基因的合成

以菌液為模板，P1、P2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)10 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳可觀察到有單一條帶，與實(shí)際條帶1 029 bp相符(圖1).

圖1　Spa-N基因PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of Spa-N gene

2.2重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定

從轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)的低鹽LB平板上挑取疑似陽(yáng)性的單菌落，接種于含ZencinTM25 μg·mL－1的LB液體培養(yǎng)基中，37℃條件下震蕩過(guò)夜，直接以菌液為模板進(jìn)行PCR鑒定，以P1、P2為引物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳，可觀察到大小約為1 029 bp的單一條帶(圖2)，而陰性對(duì)照無(wú)任何條帶.結(jié)果表明豬丹毒SpaA-N已成功插入表達(dá)載體中.

圖2　重組質(zhì)粒pPICZαC-SpaA-N的PCR鑒定Fig.2　 Identification of recombinant plasmid pPICZαC-SpaA-N by PCR

2.3重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαC-SpaA-N的單酶切及雙酶切鑒定

以抽提的質(zhì)粒分別在20 μL體系中做Xho I單酶切鑒定及Xba I和Xho I的雙酶切鑒定，并且以不加酶的重組表達(dá)質(zhì)粒作陰性對(duì)照，于37℃恒溫水浴過(guò)夜后，以1 g·L－1的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果.單酶切出現(xiàn)1條4.6 kb左右條帶，與實(shí)際相符;雙酶切出現(xiàn)2條帶，其中1條大小約為1 029 bp，與外源目的基因大小1 029 bp相符(圖3).

圖3　重組質(zhì)粒pPICZαC-SpaA-N的酶切鑒定Fig.3　 Identification of recombinant plasmid pPICZαC-SpaA-N by restriction endonucleases digestion

2.4重組表達(dá)質(zhì)粒的序列測(cè)定結(jié)果

將經(jīng)過(guò)PCR和酶切鑒定的陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒，送Invitrogen公司，用載體引物(即通用引物)對(duì)重組質(zhì)粒pPICZαC-SpaA-N進(jìn)行測(cè)序.結(jié)果顯示，目的片段與NCBI已發(fā)表的Spa-N序列的相似性高達(dá)99%.

2.5重組酵母菌液PCR鑒定

挑取電轉(zhuǎn)的陽(yáng)性菌落于1 mL的YPDS液體培養(yǎng)基中(含ZencinTM100 μg·mL－1)，30℃條件下180 r·min－1振蕩培養(yǎng)，取少量菌液進(jìn)行PCR鑒定.同時(shí)取空載體pPICZαC/X-33轉(zhuǎn)化的重組酵母菌作陰性對(duì)照，電泳檢測(cè).結(jié)果顯示:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的重組酵母菌液可以擴(kuò)增出大小約為1 029 bp的特異條帶，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母菌液在1 029 bp處無(wú)條帶(圖4).

圖4　重組酵母菌液PCR鑒定Fig.4 Identification of recombinant yeast by PCR

2.6 SpaA-N表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

高拷貝重組酵母工程菌株經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，分別于誘導(dǎo)48、72、96 h后經(jīng)10 000 r·min－1離心收集酵母上清液后進(jìn)行SDS-PAGE(12%分離膠和5%濃縮膠)表達(dá)分析，考馬斯亮藍(lán)染色鑒定.結(jié)果顯示，相對(duì)分子質(zhì)量約為40 000的Spa-N蛋白得以表達(dá)(圖5)，表明豬丹毒Spa-N蛋白在酵母X-33中成功表達(dá).

圖5　Spa-N表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analyses of expression products of Spa-N gene

2.7 SpaA-N表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot分析

表達(dá)蛋白的Western-blot免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，抗天然SpaA蛋白抗體(抗血清)和通過(guò)酵母表達(dá)的SpaA-N蛋白發(fā)生了特異性反應(yīng)，說(shuō)明SpaA-N蛋白在畢赤酵母中得到成功的表達(dá)(圖6).

圖6　SpaA-N表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot分析Fig.6 Immunoreactivies of expression products of SpaA-N gene by Western-blot

2.8免疫及動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

組1的生理鹽水對(duì)照組小鼠在攻毒后表現(xiàn)出一些不適的癥狀:食欲下降、毛發(fā)起皺及精神沉郁等，第5天開(kāi)始死亡，到第8天全部死亡.而組2的SpaAN蛋白試驗(yàn)組在攻毒的前2 d有一些不適癥狀，但到后期這些不適癥狀消失，沒(méi)有出現(xiàn)死亡情況.試驗(yàn)結(jié)果表明試驗(yàn)所表達(dá)的SpaA-N蛋白具有免疫保護(hù)性.

3　討論

現(xiàn)在世界各地豬丹毒仍頻繁爆發(fā)［26］，給世界各國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失.目前常用活菌疫苗、滅活疫苗及聯(lián)苗等來(lái)預(yù)防和控制該病的發(fā)生和傳播，但是接種活菌苗有可能使免疫動(dòng)物變成帶菌者和細(xì)菌的傳播者，從而使得慢性病例逐漸增加;滅活疫苗的培養(yǎng)液本身是異體蛋白，易使接種動(dòng)物發(fā)生過(guò)敏反應(yīng).而亞單位疫苗具有安全性高、產(chǎn)量高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，克服了活菌疫苗的毒力返強(qiáng)和滅活對(duì)豬只引起過(guò)敏反應(yīng)等缺點(diǎn).

近幾年來(lái)，相繼出現(xiàn)了一些對(duì)豬丹毒桿菌的分子生物學(xué)和免疫學(xué)的研究，Makino等［18］克隆和表達(dá)了豬丹毒絲菌表面保護(hù)性抗原SpaA，發(fā)現(xiàn)SpaA的N 端342個(gè)氨基酸殘基組成的多肽承擔(dān)了該蛋白的免疫保護(hù)功能.前人對(duì)豬丹毒桿菌SpaA的氨基酸進(jìn)行原核表達(dá)和重組疫苗的研究結(jié)果表明，SpaA-N蛋白具有良好的免疫保護(hù)作用［21-25］.但現(xiàn)如今的研究都是基于原核表達(dá)系統(tǒng)上，其表達(dá)的目的產(chǎn)物常以包涵體形式存在，無(wú)翻譯后的修飾加工過(guò)程［27］，包涵體復(fù)性困難且效率很低.而本試驗(yàn)采用的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，有著不可比擬的優(yōu)勢(shì)，其既有原核生物繁殖快、易于培養(yǎng)、培養(yǎng)基廉價(jià)和試驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單可行等特點(diǎn)，又具有強(qiáng)有力的啟動(dòng)子，還可以對(duì)外源蛋白進(jìn)行加工折疊和翻譯后修飾［28］等真核生物表達(dá)體系的特點(diǎn)，而且巴斯德畢赤酵母還是一種能高效表達(dá)外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，具有遺傳穩(wěn)定、表達(dá)水平高、蛋白可翻譯后加工、產(chǎn)物可分泌、可高密度發(fā)酵等許多優(yōu)點(diǎn)［29］.

本研究成功克隆并表達(dá)了豬丹毒絲菌C43065 SpaA的N端免疫保護(hù)片段，測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)其與NCBI上已登錄的不同血清型菌株的SpaA基因的核苷酸序列的相似性高達(dá)99%，說(shuō)明該基因具有很高的保守性.SDS-PAGE及Western-blot結(jié)果表明其具有免疫反應(yīng)性，因此，本研究為豬丹毒新型亞單位疫苗的研制和大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ).

致謝:感謝獸醫(yī)學(xué)院傳染病教研室的老師和同學(xué)給予的支持和幫助!

參考文獻(xiàn):

［1］BROOKE C J，RILEY T V.Erysipelothrix rhusiopathiae: Bacteriology，epidemiology and clinical manifestations ofan occupational pathogen［J］.J Med Microbiol，1999，48 (9) : 789-799.

［2］BOO T W，HONE R，HURLEY J.Erysipelothrix rhusiopathiae endocarditis: A preventable zoonosis［J］.Ir J Med Sci，2003，172(2) : 81-82.

［3］SITT T，BOWEN L，MYRA T，et al.Cellular immune responses in cetaceans immunized with a porcine erysipelas vaccine［J］.Vet Immunol Immunopathol，2010，137 (3/4) : 181-189.

［4］GARTRELL B D，ALLEY M R，MACK H，et al.Erysipelas in the critically endangered kakapo (Strigops habroptilus)［J］.Avian Pathol，2005，34(5) : 383-387.

［5］HASSANEIN R，SAWADA T，KATAOKA Y，et al.Serovars of Erysipelothrix species isolated from the tonsils of healthy cattle in Japan［J］.Vet Microbiol，2001，82 (1) : 97-100.

［6］BOERNER L，NEVIS K R，HINCKLEY L S，et al.Erysipelothrix septicemia in a little blue penguin (Eudyptula minor)［J］.J Vet Diagn Invest，2004，16(2) : 145-149.

［7］HOLTIFIELD J L，COOPER G L，CHARLTON B R.An outbreak of erysipelas in 2-day-old poultry［J］.Avian Pathol，2000，44(33) : 721-724.

［8］CHEUN H I，KAWAMOTO K，HIRAMATSU M，et al.Protective immunity of SpaA-antigen producing lactococcus lactis against Erysipelothrix rhusiopathiae intfection［J］.J Appl Microbiol，2004，96(6) : 1347-1353.

［9］HASSANEIN R，SAWADA T，KATAOKA Y，et al.Pathogenicity for mice and swine of Erysipelothrix isolates from the tonsils of healthy cattle［J］.Vet Microbiol，2003，91(2/3) : 231-238.

［10］朱鳳瓊，陳達(dá)燕，夏英杰，等.豬丹毒桿菌的分離及鑒定［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012(4) : 316-317.

［11］邱美珍，杜麗飛，楊?lèi)?ài)梅，等.豬丹毒桿菌臨床分離鑒定與藥敏試驗(yàn)［J］.養(yǎng)豬，2011(6) : 111-112.

［12］郭良興，陳克研，趙魁，等.豬丹毒桿菌的分離鑒定及耐藥性試驗(yàn)［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011，38(4) : 199-202.

［13］車(chē)勇良，陳如敬，王隆柏，等.豬丹毒桿菌的分離鑒定及其SpaA基因的遺傳變異分析［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，31(11) : 1591-1593.

［14］萬(wàn)莉，韓國(guó)全，郭萬(wàn)柱，等.豬丹毒疫苗研究進(jìn)展［J］.豬業(yè)科學(xué)，2010(6) : 32-35.

［15］周緒斌，丹尼，李聰，等.豬丹毒———古老的傳染病是否從中國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)消失了［J］.農(nóng)業(yè)新技術(shù)，2009 (5) : 22-24.

［16］FREDDY H，F(xiàn)RANK P，KOEN C，et al.Efficacy of vaccines against bacterial diseases in swine: What can we expect［J］.Vet Microbiol，2004，100(3/4) : 255-268.

［17］SILVA A J，HORTA A C，IEMMA M，et al.Production of potential subunit vaccine against swine erysipelas in fedbatch cultures of E.coli BL21(DE3)［J］.New Biotechnol，2009，255(6) : 187-188.

［18］MAKINO S，YAMAMOTO K，MURAKAMI S，et al.Properties of repeat domain found in a novel protective antigen，SpaA，of Erysipelothrix rhusiopathiae［J］.Microb Pathog，1998，25(2) : 101-109.

［19］IMADA Y，GOJI N，ISHIKAWA H，et al.Truncated surface protective antigen (SpaA) of Erysipelothrix rhusiopathiae serotypes 1a and 2b in pigs［J］.Infect Immun，1999，67(9) : 4376-4382.

［20］ALAINA L I，JAMES A R，PAUL J H.Erysipelothrix rhusiopathiae: Association of Spa-type with serotype and role in protective immunity［J］.Vaccine，2010，28 (13) : 2490-2496.

［21］曹文堯.丹毒絲菌表面保護(hù)抗原A作為重組亞單位疫苗和核酸疫苗的初步研究［D］.烏魯木齊:新疆大學(xué)，2007.

［22］譚侃侃.丹毒絲菌的分離鑒定及其SpaA-N蛋白和lipo蛋白的免疫原性分析［D］.長(zhǎng)沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［23］吾魯木汗·那孜爾別克，張磊，何翠，等.豬丹毒絲菌天然SpaA和重組SpaA-N免疫保護(hù)效果的評(píng)價(jià)［J］.微生物學(xué)報(bào)，2010，50 (3) : 367-372.

［24］李偉杰，趙耘，康凱，等.紅斑丹毒絲菌SpaA抗原基因的克隆、序列分析及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，31(11) : 1591-1594.

［25］DA A J，SILVA M R，IEMMA A C，et al.Cloning，autoinduction expression，and purification of rSpaA swine erysipelas antigen［J］.Curr Microbiol，2012，65(4) : 369-374.

［26］OPRIESSNIG T L，HOFFMAN J，HARRIS D L，et al.Erysipelothrix rhusiopathiae: Genetic charact erization of Midwest US isolates and live commercial vaccines using pulsed field gel electrophoresis［J］.J Vet Diagn Invest，2004，16(2) : 101-107.

［27］JIN F L，XU X X，YU X Q，et al.High-level expression of active recombinant ubiquitin carboxyl terminal hydrolase of drosophila melanogaster in Pichia pastoris［J］.Protein Expr Purif，2009，65(2) : 115-121.

［28］楊梅，溫真，林麗玉.畢赤酵母蛋白表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2011(4) : 46-51.

［29］DALY R，HEARN M T W.Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: A useful experimental tool in protein engineering and production［J］.J Mol Recognit，2005，18(2) : 119-138.

【責(zé)任編輯柴焰】

Cloning surface protective antigen A gene from Erysipelothrix rhusiopathiae and its expression in Pichia pastoris

JIANG Zhiqiong，ZHONG Zemin，TAN Bomin，YU Xiyao，HUANG Yumao
(College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

Abstract:【Objective】Immunization protection area protein，which lies in the N-terminal protective domain of surface protective antigen A(SpaA) of Erysipelothrix rhusiopathiae，was expressed in Pichia pastoris X-33.【Method】Using the swine erysipelas，which was isolated from a pig farm in Guangdong as template，a pair of primers was designed according to the cDNA sequence of Spa gene from NCBI.The amino terminal sequence was achieved by PCR amplification，after being inserted into the expression vector pPICZαC to get the recombinant plasmid of pPICZαC-SpaA-N.Recombinant plasmid of pPICZαCSpaA-N by Sac I enzyme was linearized，and electro transformed it into P.pastoris X-33.The positive transformant，screened by YPDS tablet with ZencinTMand identified by PCR at different concentrations of ZencinTM，achieved the high number of copies which were induced and cultured by methanol.Supernatant was collected by centrifugation at 48，72，96 h respectively after induction，and SDS-PAGE and Western-blot tests were carried out.【Result and conclusion】The SpaA gene was successfully cloned and expressed，and the recombinant plasmid of pPICZαC-SpaA-N was constructed.The immunization protection area protein，which lies in SpaA gene amino terminal of swine E.rhusiopathiae in P.pastoris X-33，was successfully expressed.SpaA gene of swine E.rhusiopathiae has been successfully expressed asim-book=21,ebook=25munization protection area protein in yeast host，which will lay a foundation for the development and the mass production of subunit vaccine of swine E.rhusiopathiae.

Key words:Erysipelothrix rhusiopathiae; SpaA gene; Pichia pastoris; cloning and expression; subunit vaccine

作者簡(jiǎn)介:蔣志瓊(1987—)，女，碩士研究生，E-mail: 827209378@ qq.com;通信作者:黃毓茂(1964—)，男，副教授，博士，E-mail: ymaohuang@ scau.edu.cn

收稿日期:2014-04-21

文章編號(hào):1001-411X(2015) 03-0020-06

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類(lèi)號(hào):S855