張克山，陳芳艷，劉　金，蔡絲絲，劉湘紅，張靖鵬，陳瑞愛，3，王林川，3(華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州5064; 華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣東廣州5064;3廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司，廣東新興57400)

珠三角地區(qū)鴨坦布蘇病毒的全基因序列測定與分析

張克山1，陳芳艷2，劉金1，蔡絲絲1，劉湘紅1，張靖鵬1，陳瑞愛1，3，王林川1，3
(1華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州510642; 2華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣東廣州510642;
3廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司，廣東新興527400)

摘要:【目的】了解2010年以來分離于珠三角地區(qū)鴨坦布蘇病毒病(Duck Tembusu virus，DTMUV) GDNS2010.1、GDNS2010.2、GDZQ2012、GDPY2013株的分子特征.【方法】參考GenBank收藏的DTMUV JS804株，共設(shè)計合成11對特異性引物，擴增了4株病毒的全基因序列片段.【結(jié)果和結(jié)論】4株病毒全長約為10 990 bp，無Ploy(A)尾結(jié)構(gòu)，僅含有1個大的ORF，共編碼3 426個氨基酸，5'非編碼區(qū)(5'UTR)各含有94 bp.在3'非編碼區(qū)(3'UTR)，GDNS2010.1、GDNS2010.2毒株在103 395～103 411 bp處缺失10個堿基.聯(lián)合前期試驗已測定的2株病毒序列(GDHZ2012.1、GDHZ2012.2)，用DNAstar和MEGA6.0序列分析軟件將6株病毒同GenBank收藏的國內(nèi)的其他坦布蘇病毒株比對，發(fā)現(xiàn)核酸序列相似性在98%以上，與Ntaya病毒和Sitiawan病毒相似性較大，相似性都在73%左右;與西尼羅河病毒、日本乙型腦炎病毒、黃熱病毒等相似性皆低于63%.6株病毒囊膜蛋白E核酸序列相似性為97.5%～99.9%，推導氨基酸序列相似性在97%以上，其中同一地區(qū)分離的毒株相似性最高，達99.9%;在囊膜蛋白E154位存在一潛在的糖基化位點Asn-Try-Ser，在E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅱ第E289位，極性帶正電荷的Lys變?yōu)闃O性帶負電荷的Glu，推測這一位點可能為病毒的毒力位點.

關(guān)鍵詞:鴨坦布蘇病毒;克隆測序;全基因組序列;囊膜蛋白毒力位點;鴨黃病毒

張克山，陳芳艷，劉金，等.珠三角地區(qū)鴨坦布蘇病毒的全基因序列測定與分析［J］.華南農(nóng)業(yè)大學學報，2015，36(3) : 13-19.

優(yōu)先出版時間:2015-04-14

優(yōu)先出版網(wǎng)址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20150414.0924.001.html

鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)屬于黃病毒科黃病毒屬恩他耶病毒群，其基因組結(jié)構(gòu)與其他黃病毒相似，是一種約有11 kb單股正鏈的RNA病毒.基因組僅有1個大的閱讀框架(ORF)，兩端是與病毒復制有關(guān)的5'端和3'端非編碼區(qū)［1-2］.基因組編碼1個大的蛋白前體，后在宿主信號肽酶和病毒絲氨酸蛋白酶的共同催化作用下裂解為3個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白，在基因組中的順序為: 5'-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3'，其中E蛋白是黃病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒吸附、與宿主細胞膜融合以及病毒組裝過程中具有重要的作用.同時，E蛋白也是黃病毒主要的病毒抗原，含有多種抗原表位，可通過誘發(fā)中和抗體產(chǎn)生保護性免疫應答［3］.NS5是最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，含有910個氨基酸，具有RNA依賴性RNA聚合酶、甲基轉(zhuǎn)移酶、鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶等多種酶活性［4］.Forwood等［5］發(fā)現(xiàn)登革病毒NS5莖環(huán)區(qū)的37個氨基酸(369～405位氨基酸)含有核定位信號(Nuclear localization signal，NLS)，在氨基端的327～343氨基酸含有核輸出序列(NES)，在病毒基因組的復制過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用.了解病毒基因結(jié)構(gòu)特點是分析病毒遺傳進化、生長繁殖、毒力、致病機理的分子基礎(chǔ)，有助于進一步的研究鴨黃病毒病工作的開展.因此本文測定并分析了2010—2013年分離于珠三角的6株鴨源坦布蘇病毒全基因結(jié)構(gòu).

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1病毒與鴨胚鴨黃病毒為廣東自然分離毒株，鴨胚由云城溫氏公司孵化場提供.

1.1.2菌株與載體大腸埃希菌Escherichia coli DH5a由廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司生藥研發(fā)中心保存，pGEM-T-easy vector system為Promega公司產(chǎn)品.

1.1.3主要試劑RNA/DNA抽提試劑盒、DNA Marker DL2000、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、(10×) PCR Buffer(含Mg2 +)、dNTP、PrimeSTAR Max高保真DNA聚合酶、rTaq聚合酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品;凝膠回收試劑盒、小質(zhì)粒抽提試劑盒為Omega公司產(chǎn)品;氨芐青霉素(Amp)為Invirtogen公司產(chǎn)品; LB培養(yǎng)基購自廣州環(huán)凱生物技術(shù)公司.

1.2試驗方法

1.2.1鴨坦布蘇病毒全基因序列的引物設(shè)計與合成

參照GenBank收藏的坦布蘇病毒JS804株(登錄號: NC_015843)序列，應用Primer premier5.0軟件設(shè)計引物，見表1，由廣州英濰捷基貿(mào)易有限公司合成.

1.2.2病毒RNA的抽提與目的基因擴增參照TaKaRa產(chǎn)品RNA/DNA抽提試劑盒說明書步驟抽提病毒RNA.利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa公司)和隨機引物將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA:取模板2 μL、Random Primer 1 μL和RNase free ddH2O至6 μL，70℃作用10 min后冰上急冷2 min;離心數(shù)秒后，將上述模板變性溶液6 μL與2 μL 5×M-MLV Buffer、0.5 μL dNTP-Mixture、0.25 μL RNase Inhibitor、0.25 μL RNase M-MLV、1 μL RNase free ddH2O混勻，合成第1鏈cDNA，反應條件: 30℃10 min，42℃1 h，70℃15 min，結(jié)束反應.取轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，分別用上下游引物進行PCR擴增，反應體系為: 2×PrimeSTAR Max高保真DNA聚合酶預混劑25 μL、上下游引物各1 μL、cDNA模板2 μL，滅菌ddH2O至50 μL，PCR反應條件: 95℃預變性5 min; 98℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸時間根據(jù)片段大小而定(10 s·kb－1)，35個循環(huán); 72℃10 min，獲得目的片段.

表1　鴨坦布蘇病毒病全基因組的PCR擴增引物Tab.1 PCR primers for amplification of the full-length genome of duck Tembusu virus

1.2.3目的基因的克隆與測序PCR擴增產(chǎn)物加A堿基后，經(jīng)0.01 g·mL－1瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段;取目的片段連接pGEM-T-easy vector載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞;轉(zhuǎn)化后均勻涂布于含100 μg·mL－1的Amp的LB瓊脂板上，過夜，挑取可疑陽性菌落，搖菌，抽提質(zhì)粒PCR鑒定為陽性后送英濰捷基公司測序.

1.2.4目的基因的序列結(jié)果與分析測序結(jié)果通過國際互聯(lián)網(wǎng)提交NCBI Blast Server進行聯(lián)機檢索，以及與GenBank中注冊的其他黃病毒的相應核苷酸序列進行比較分析.應用DNAstar(Version 5.07)分析軟件，將所獲得的4株鴨坦布蘇病毒基因片段的序列分別進行整理和拼接，形成完整的病毒基因序列.聯(lián)合GDHZ2012.1、GDHZ2012.2病毒序列，DNAstar的MegAlign中的clustal W method算法比較不同地區(qū)的鴨坦布蘇病毒各蛋白的核苷酸和氨基酸序列相似性，用Mega 6.0軟件的NJ算法，繪制出系統(tǒng)發(fā)育進化樹.

2　結(jié)果

2.1全基因組各片段的擴增

使用設(shè)計的引物經(jīng)PCR擴增目的基因，電泳后獲得了與預期大小相符的條帶(圖1).

圖1　GDNS2010.1(a)、GDZQ2012(b)、GDNS2010.2(c)、GDPY2013(d)全基因序列片段的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of the complete genome of GDNS2010.1(a)，GDZQ2012(b)，GDNS2010.2(c)，GDPY2013(d)

2.2全基因組相似性與進化分析

測序結(jié)果經(jīng)SeqMan軟件去載體、拼接后，得到了病毒的全長核苷酸序列，其中GDNS2010.1、GDNS2010.2兩毒株在103 395～103 411 bp處缺失10個堿基;編碼區(qū)位于95～10 372 bp，共編碼3 462個氨基酸;將拼接好的序列與GenBank上收藏的16個相關(guān)病毒序列(包含10個TMUV和6個黃病毒屬成員病毒)，見表2前16條序列.經(jīng)MegAlign軟件比對(圖2) :分離株與其他TMUV毒株相似性都在98%以上，其中GDHZ2012.1與GDPY2013兩毒株與參考毒株JS804相似性最高，分別為99.4%、99.3%;進化樹分析顯示，GDPY2013株與JS804處在同一節(jié)點;在6毒株之間，GDZQ2012與其他毒株差異最大，分離于同一地方的GDNS2010.1、GDNS2010.2和GDHZ2012.1、GDHZ2012.2的核苷酸相似性很高，處于進化樹上的同一節(jié)點，可能由同一毒株進化得到.與黃病毒屬成員相比較發(fā)現(xiàn):相似性最高的是Sitiawan病毒，相似性為87.5%～88.1%，其次為Ntaya-IPDIA株和以色列的火雞腦脊髓炎病毒，相似度都為72%以上，而西尼羅河病毒、日本乙型腦炎病毒、黃熱病毒等相比較，相似性皆低于63%.

2.3病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白E基因分析

表2　參考毒株及序列登錄號Tab.2　 Reference strains in GenBank and their accession numbers

圖2　鴨坦布蘇病毒株進化樹(鄰接法)Fig.2 Phylogenetic tree of DTMUV strains(by NJ method)

將病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白E蛋白與其他TMUV(參考株見表2后4條序列)比較發(fā)現(xiàn)，核苷酸序列相似性為97.5%～99.3%，推導氨基酸序列相似性在97%以上(圖3).由圖3可見，根據(jù)較保守的病毒E基因序列分析建樹發(fā)現(xiàn):珠三角分離的6株毒與國內(nèi)其他地區(qū)分離的毒株在遺傳關(guān)系上JS804與GDHZ2012.1、GDHZ2012.2、GDPY2013，GDZQ2012 與SHYG-1，GDNS2010.1、GDNS2010.2與Fengxian-1分別有共同節(jié)點.這提示DTUMV病毒可能在近3年來并未形成較大差異的地方毒株.GDNS2010.1、GDNS2010.2、GDZQ2012、GDHZ2012.1、GDHZ2012.2、GDPY2013各毒株與參考毒株JS804相比較堿基變化較多，但多為無義突變.6株毒株間推導氨基酸變化情況見表3: GDHZ2012.1、GDHZ2012.2第128位氨基酸由極性帶正電荷的Arg變?yōu)榉菢O性不帶電荷的Met; GDHZ2012.2第289位由極性帶正電荷的Lys變?yōu)闃O性帶負電荷的Glu;在第458位由極性不帶電荷的Ser變?yōu)榉菢O性Pro; GDPY2013株在313位由極性帶正電荷的Arg變?yōu)榉菢O性不帶電荷的Met.這些改變蛋白極性或帶電荷數(shù)的位點很可能就是潛在的毒力位點.另外，囊膜蛋白第154位存在一個潛在的糖基化位點(Asn154-Try-Ser)，這一位點在大多數(shù)黃病毒中保守［6］.

圖3　鴨坦布蘇病毒E基因遺傳進化樹分析(鄰接法)Fig.3 Phylogenetic tree of envelope gene of DTMUV strains(by NJ method)

表3　E基因推導氨基酸突變表Tab.3 The mutations in the deduced amino acid sequences of envelope gene

3　討論

2010年鴨坦布蘇病毒病的突然爆發(fā)與迅速蔓延給我國水禽養(yǎng)殖帶來了巨大的經(jīng)濟損失.目前認為鴨坦布蘇病毒只感染鴨、鵝、家雀，但同時鴨黃病毒屬于黃病毒科黃病毒屬的成員;而黃病毒屬中大量成員威脅人類健康，如日本乙型腦炎、登革熱、黃熱病、蜱傳染性腦炎等［7-8］.Tang等［9］對132份來自鴨產(chǎn)業(yè)工作人員的血清檢測發(fā)現(xiàn)其抗體陽性率達71.9%，63份口腔拭子檢測病毒RNA陽性率達47.7%，這是否意味著鴨坦布蘇病毒同其他的黃病毒屬成員一樣具有公共衛(wèi)生意義還需進一步確認.雖鴨坦布蘇病毒是一種國內(nèi)新發(fā)疾病，但近兩年報道病毒的全基因序列已有幾十條，Yu等［3］對2010—2012年分離到的6株坦布蘇病毒的E蛋白結(jié)構(gòu)、抗原性和進化特性的研究發(fā)現(xiàn)，坦布蘇病毒分I、Ⅱ2個基因型，Ⅱ為主要的基因型，他們還發(fā)現(xiàn)病毒E蛋白氨基酸突變位點有13處，而中和試驗病毒的中和特性卻沒有表現(xiàn)出差異.本試驗將2010—2013年分離測序獲得的6株病毒核苷酸序列與GenBank收藏的10株坦布蘇病毒相比較，發(fā)現(xiàn)6毒株的核苷酸相似性與近4年國內(nèi)報道的坦布蘇病毒的核苷酸序列相似性都很高，在97%以上，這提示在4年間里坦布蘇病毒并未發(fā)生大的變異，感染宿主范圍并沒有擴大;國內(nèi)也未出現(xiàn)如2010年的大范圍流行，僅出現(xiàn)地方性流行［10］.這可能一方面與感染宿主逐漸產(chǎn)生特異性抗體，形成了免疫保護有關(guān);另一方面可能與目前國內(nèi)缺乏有效防治此病疫苗與藥物的情況有關(guān)，在這種情況下病毒面臨的選擇壓力小，沒能使病毒發(fā)生大的新的變異.但這不能否認病毒在各個地方呈現(xiàn)地方特色，如在前期試驗中，筆者發(fā)現(xiàn)這6毒株中2012年分離于惠州的2株病毒就存在毒力差異，測定發(fā)現(xiàn)GDHZ2012.1的EID50比GDHZ2012.2的EID50高出2個稀釋度，第5代毒顱內(nèi)接種7日齡小鴨時前者能引起明顯的臨床癥狀，甚至死亡，后者發(fā)病較緩，且臨床癥狀較輕［11］.巧合的是在E蛋白基因序列里GDHZ2012.2比GDHZ2012.1多2個突變位點，尤其是GDHZ2012.2第289位由極性帶正電荷的Lys變?yōu)闃O性帶負電荷的Glu，這一位點使得蛋白的帶電荷數(shù)發(fā)生改變.已有研究表明，第289位氨基酸位于E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅱ中，結(jié)構(gòu)域Ⅱ中有糖基化位點和具有血清學及生物活性的抗原表位［12-14］.

在序列拼接完成后，發(fā)現(xiàn)GDNS2010.1、GDNS2010.2毒株在103 395～103 411 bp處缺失10個堿基.有趣的是這2毒株的EID50都不高，第5代毒的EID50分別為10-3.13、10-2.8，這段缺失序列處在病毒的3'UTR，這段缺失的序列是否是病毒復制能力低于其他4株毒的原因，可通過感染性克隆技術(shù)作進一步研究確認，文獻報道的是黃病毒的3'UTR影響著病毒的復制、增殖，調(diào)控病毒翻譯效率［15-16］.

鴨坦布蘇病毒病作為一種國內(nèi)新發(fā)的傳染性疾病，目前對于其流行病學特點、致病機理等生物學特征尚不是很清楚，臨床上缺乏有效的檢測手段與防治疫苗、藥物;也不清楚是否威脅人類健康.本文測定分析了2010—2013年間分離于珠三角地區(qū)的6株鴨源坦布蘇病毒，為下一步的疫苗篩選、分子診斷、反向操作奠定了基礎(chǔ).

參考文獻:

［1］BAI X，LU R，LIU C，et al.Molecular characterization of a duck Tembusu virus from China［J］.Virus Genes，2013，47(3) : 478-482.

［2］MUKHOPADHYAY S，KUHN R J，ROSSMANN M G.A structural perspective of the flavivirus life cycle［J］.Nat Rev Microbiol，2005，3(1) : 13-22.

［3］YU K，SHENG Z Z，HUANG B，et al.Structural，antigenic，and evolutionary characterizations of the envelope protein of newly emerging duck Tembusu virus［J］.PLoS One，2013，8(8) : e71319.

［4］LU G，GONG P.Crystal structure of the full-length Japanese encephalitis virus NS5 reveals a conserved methyltransferase-polymerase interface［J］.PLoS Pathog，2013，9(8) : e1003549.

［5］FORWOOD J K，BROOKS A，BRIGGS L J，et al.The 37-amino-acid interdomain of dengue virus NS5 protein contains a functional NLS and inhibitory CK2 site［J］.Biochem Biophys Res Commun，1999，257 (3) : 731-737.

［6］ZHANG Y，CHEN P，CAO R，et al.Mutation of putative N-linked glycosylation sites in Japanese encephalitis virus premembrane and envelope proteins enhances humoral immunity in BALB/C mice after DNA vaccination［J］.Virol J，2011，8: 138.

［7］TANG Y，DIAO Y，YU C，et al.Characterization of a Tembusu virus isolated from naturally infected house sparrows (Passer domesticus) in Northern China［J］.Transbound Emerg Dis，2013，60(2) : 152-158.

［8］ZHU W，CHEN J，WEI C，et al.Complete genome sequence of duck Tembusu virus，isolated from Muscovy ducks in southern China［J］.J Virol，2012，86(23) : 13119.

［9］TANG Y，GAO X，DIAO Y，et al.Tembusu virus in human，China［J］.Transbound Emerg Dis，2013，60(3) : 193-196.

［10］劉志剛，孫青松，姚蓉，等.鴨坦布蘇病毒研究進展［J］.中國動物傳染病學報，2013，21(1) : 81-86.

［11］李慶陽，陳芳艷，劉平，等.鴨坦布蘇病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法的建立［J］.動物醫(yī)學進展，2012，33(7) : 18-22.

［12］GRITSUN T S，HOLMES E C，GOULD E A.Analysis of flavivirus envelope proteins reveals variable domains that reflect their antigenicity and may determine their pathogenesis［J］.Virus Res，1995，35(3) : 307-321.

［13］KIMURA-KURODA J，YASUI K.Antigenic comparison of envelope protein E between Japanese encephalitis virus and some other flaviviruses using monoclonal antibodies ［J］.J Gen Virol，1986，67(Pt 12) : 2663-2672.

［14］張羽，曹瑞斌，顧金燕，等.豬源乙型腦炎病毒NJ2008 株E138位突變病毒的構(gòu)建與生物學特性初步研究［C］∥佚名.中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)公共衛(wèi)生學分會第二次學術(shù)研討會論文集.北京:中國畜牧獸醫(yī)學會，2014: 312-315.

［15］ALVAREZ D E，EZCURRA A L D L，F(xiàn)UCITO S，et al.Role of RNA structures present at the 3' UTR of dengue virus on translation，RNA synthesis，and viral replication ［J］.Virology，2005，339(2) : 200-212.

［16］PROUTSKI V，GOULD E A，HOLMES E C.Secondary structure of the 3' untranslated region of flaviviruses: Similarities and differences［J］.Nucleic Acids Res，1997，25 (6) : 1194-1202.

【責任編輯柴焰】

Molecular cloning and sequence analyses of the complete genome of duck Tembusu virus isolated from the Pearl River Delta region

ZHANG Keshan1，CHEN Fangyan2，LIU Jin1，CAI Sisi1，LIU Xianghong1，ZHANG Jingpeng1，CHEN Ruiai1，3，WANG Linchuan1，3
(1 College of Veterinary，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China; 2 College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China;
3 Guangdong Dahuanong Animal Health Products Co.，Ltd.，Xinxing 527400，China)

Abstract:【Objective】In order to comprehend the molecular characteristics of duck Tembusu virus，the isolations of GDNS2010.1，GDNS2010.2，GDZQ2012，GDPY2013 in the Pearl River Delta region were analyzed.【Method】From the reference strains (GenBank accession no.JS804)，eleven pairs of specific primers were designed and synthesized to amplify genome sequence fragments of GDNS2010.1，GDNS2010.2，GDZQ2012，GDPY2013.The whole genome sequences of these four viruses were obtained.The complete genome sequences of four viruses were obtained by sequencing and splicing.【Re-book=14,ebook=18sult and conclusion】Analyses showed that the full length of these four viruses was 10 990 bp，no Ploy (A) tail structure comprising one large ORF，encoding 3 426 amino acids.The 5' non-coding region (5' UTR) contained 94 bp.Ten bases were missing from 103 395 bp to 103 411 bp of GDNS2010.1 and GDNS2010.2 strains in the 3' non-coding region (3' UTR).Two sequences of GDHZ2012.1 and GDHZ2012.2 preliminarily determined were joined for a sequence analysis.DNAstar and MEGA6.0 were used to analyze the sequences of six virus strains.Comparisons with other domestic Tembusu viruses recorded in GenBank showed that the similarity of the nucleic acid sequence was more than 98%.In comparison with Ntaya virus，Sitiawan virus，the similarity was about 73%.Compared with West Nile virus，Japanese encephalitis virus and yellow fever virus，the similarities were less than 63%.The similarity for nucleic acid sequence of envelope protein in the six isolates remained between 97.5%－99.9%; the similarity of deduced amino acid sequence was found to be more than 97% whereas isolates from the same area had 99.9% similarity.In the site of E154 in envelope，there are a potential glycosylation site Asn-Try-Ser and a potential virulence loci in E289.

Key words:duck Tembusu virus; cloning and sequencing; complete genome sequence; virulence loci in envelope protein; duck flavivirus

基金項目:廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司科研基金(113A2012206-1)

作者簡介:張克山(1988—)，女，碩士，E-mail: zhangksh1988@ 163.com;通信作者:王林川(1965—)，男，教授，博士，E-mail: lcwang@ scau.edu.cn

收稿日期:2014-04-09

文章編號:1001-411X(2015) 03-0013-07

文獻標志碼:A

中圖分類號:S855.3