劉珍珍，李　亮，孫　堅(jiān)，廖曉萍，劉雅紅(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/國(guó)家獸藥安全評(píng)價(jià)(環(huán)境評(píng)估)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510642)

華南地區(qū)豬場(chǎng)環(huán)境中蔬菜細(xì)菌攜帶耐藥基因情況調(diào)查

劉珍珍，李亮，孫堅(jiān)，廖曉萍，劉雅紅
(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/國(guó)家獸藥安全評(píng)價(jià)(環(huán)境評(píng)估)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510642)

摘要:【目的】了解華南地區(qū)豬場(chǎng)環(huán)境中蔬菜樣品附生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌的耐藥基因攜帶情況.【方法】采用PCR結(jié)合測(cè)序的方法檢測(cè)氨基糖苷類、四環(huán)素類、β－內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類和林可霉素類耐藥基因的攜帶情況.【結(jié)果和結(jié)論】四環(huán)素類耐藥基因的分布范圍比較廣，附生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌中此類耐藥基因的場(chǎng)區(qū)檢出率均為90%(9/10) ;蔬菜樣品附生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌所含的耐藥基因是有差別的，而且附生細(xì)菌中的耐藥基因比內(nèi)生細(xì)菌的豐富，A、B、C、D、E、F、G、H、I和J樣品附生細(xì)菌耐藥基因的檢出率分別是77.78% (21/27)、92.59% (25/27)、92.59%(25/27)、51.85% (14/27)、33.33% (9/27)、92.59% (25/27)、77.78% (21/27)、7.41% (2/27)、81.48% (22/27)和77.78% (21/27)，內(nèi)生細(xì)菌耐藥基因的檢出率分別是0(0/27)、11.11% (3/27)、11.11% (3/27)、11.11%(3/27)、29.63% (8/27)、48.15% (13/27)、29.63% (8/27)、33.33% (9/27)、25.93% (7/27)和22.22% (6/27).表明蔬菜中細(xì)菌的耐藥情況，尤其是附生細(xì)菌的耐藥情況可能已經(jīng)非常嚴(yán)重，長(zhǎng)此以往甚至?xí)种谱魑锷L(zhǎng)，并且通過(guò)食物鏈危及動(dòng)物和人體健康，應(yīng)引起足夠的重視.

關(guān)鍵詞:蔬菜樣品;耐藥基因;附生細(xì)菌;內(nèi)生細(xì)菌;豬場(chǎng)

劉珍珍，李亮，孫堅(jiān)，等.華南地區(qū)豬場(chǎng)環(huán)境中蔬菜細(xì)菌攜帶耐藥基因情況調(diào)查［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36(3) : 1-7.

優(yōu)先出版時(shí)間:2015-04-14

優(yōu)先出版網(wǎng)址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20150414.0953.021.html

在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，抗生素作為禽畜疾病預(yù)防及治療藥物、生長(zhǎng)促進(jìn)劑、飼料添加劑等被廣泛應(yīng)用.抗生素的大量使用是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的重要原因之一［1］，同時(shí)也刺激了耐藥基因的傳播，耐藥基因已經(jīng)成為環(huán)境中的重要污染源.世界衛(wèi)生組織已將抗生素耐藥基因作為21世紀(jì)威脅人類健康最重大的挑戰(zhàn)之一，并宣布將在全球范圍內(nèi)對(duì)控制耐藥基因做戰(zhàn)略部署.耐藥基因作為一類新型的環(huán)境污染物，與其他污染物不同之處是它具有遺傳性，而且可以通過(guò)物種間遺傳物質(zhì)的交換無(wú)限制地傳播.耐藥基因一旦進(jìn)入環(huán)境中，會(huì)持久性地存在，很難控制和消除，將對(duì)人類的公共衛(wèi)生和食品、飲用水的安全構(gòu)成威脅，損害人體的健康.研究表明，即使攜帶抗生素耐藥基因的微生物菌株死亡后，攜帶抗生素耐藥基因的裸露DNA也可以在脫氧核糖核酸酶(DNAse)的保護(hù)下在環(huán)境中長(zhǎng)期存在，直到環(huán)境中這些裸露的DNA分子最終轉(zhuǎn)入到其他生物體細(xì)胞內(nèi)，即使選擇壓力消失，這些產(chǎn)生的耐藥基因也不會(huì)隨之消失［2］.

植物附生菌是一類附著在植物表面、以植物分泌物為營(yíng)養(yǎng)的微生物類群.內(nèi)生菌是指在其生活史的某一個(gè)階段或整個(gè)階段生活于健康植物各種組織和器官內(nèi)部或細(xì)胞間隙并且正常情況下不引起病害的微生物，包括細(xì)菌、真菌、放線菌等［3］.有關(guān)蔬菜細(xì)菌的報(bào)道大多集中于細(xì)菌的生物多樣性及其在植物中的分布，以及它們的生物學(xué)作用等方面，國(guó)外對(duì)環(huán)境中耐藥基因的研究又大多集中于醫(yī)院和水環(huán)境(包括地表水、地下水、沉積物和污水處理廠等).因此對(duì)蔬菜中耐藥基因的污染水平和種類進(jìn)行調(diào)查是非常有必要的.本試驗(yàn)就華南地區(qū)蔬菜中細(xì)菌的耐藥基因攜帶情況進(jìn)行調(diào)查，以期為保障蔬菜等植物性食品的質(zhì)量安全和人畜健康提供科學(xué)依據(jù).

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品受試樣品是2012—2013年從華南地區(qū)10個(gè)不同豬場(chǎng)采集的地瓜葉、生菜、白菜和蔥等蔬菜.樣品編號(hào)為A～J，詳見(jiàn)表1.

表1　華南地區(qū)采集的蔬菜樣品Tab.1 Vegetable samples selected from Southern China

1.1.2主要試劑與儀器液氮購(gòu)自佛山氣體公司; NA瓊脂、NB肉湯購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;次氯酸鈉、無(wú)水乙醇、PBS為北京普博欣公司產(chǎn)品; rTaq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、dNTP Mixture、DNA提取試劑盒Bacterial DNA Kit為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;瓊脂糖為西班牙Biowest公司產(chǎn)品.

1.2方法

1.2.1樣品的采集豬場(chǎng)的菜地采樣按照“S”形法布點(diǎn)，采樣點(diǎn)不少于5個(gè)，同一豬場(chǎng)菜地采集的樣品混合成1份樣品.按試驗(yàn)所用量的3倍采集蔬菜的莖、葉，分別裝入塑料袋，粘貼標(biāo)簽，扎緊袋口.采集好的樣品放入冷藏箱中(4℃)，立即送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析檢驗(yàn).

1.2.2細(xì)菌的提取(前處理)將蔬菜樣品用雙蒸水沖洗干凈.先用體積分?jǐn)?shù)為1%的次氯酸鈉和體積分?jǐn)?shù)為0.02%吐溫－20的混合溶液浸泡1 min，再用體積分?jǐn)?shù)為75%無(wú)水乙醇浸泡1 min，最后用PBS溶液浸泡3次，每次1 min.用無(wú)菌水充分淋洗，無(wú)菌濾紙吸干.在超凈工作臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌手術(shù)刀將莖切成0.1～0.5 cm的小段，將葉切成0.5 cm×0.5 cm的小塊.附生細(xì)菌的提取:取10 g切好的莖、葉，加入20 mL含質(zhì)量濃度為0.008 5 kg·L－1的NaCl溶液和體積分?jǐn)?shù)為0.01%吐溫－20的混合溶液，于4℃條件下浸泡1 h，將浸泡液用無(wú)菌水梯度稀釋至10－2、10－3、10－4，取200 μL稀釋液均勻涂布于NA平板上，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)，靜置30 min后，倒置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d.內(nèi)生細(xì)菌的提取:取10 g切好的莖、葉，加入20 mL含質(zhì)量濃度為0.008 5 kg·L－1的NaCl溶液和體積分?jǐn)?shù)為0.01%吐溫－20的混合溶液，于4℃條件下浸泡1 h，用體積分?jǐn)?shù)為75%無(wú)水乙醇浸泡1 min，再用體積分?jǐn)?shù)為5%的次氯酸鈉溶液浸泡5 min，用無(wú)菌水充分淋洗，無(wú)菌濾紙吸干.最后加適量液氮到陶瓷研缽中迅速、充分研磨.取100 μL研磨液加入NB培養(yǎng)液中，于37℃恒溫振蕩器培養(yǎng)24 h，然后將培養(yǎng)液用無(wú)菌水梯度稀釋至10－2、10－3、10－4，取200 μL稀釋液均勻涂布于NA平板上，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)，正置30 min后，倒置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d.

1.2.3基因的提取選取長(zhǎng)有100～200個(gè)單菌落的梯度稀釋的NA平板，用10 mL滅菌雙蒸水將單菌落沖洗下來(lái)，按照E.Z.N.A.Bacterial DNA Kit試劑盒的說(shuō)明書提取細(xì)菌DNA.

1.2.4引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)參考文獻(xiàn)報(bào)道的相應(yīng)基因的引物序列，由北京華大生物工程有限公司合成引物.將引物用滅菌雙蒸水進(jìn)行100倍稀釋，存放至4℃冰箱，引物使用時(shí)置于冰上.所用引物見(jiàn)表2.

1.2.5目的基因測(cè)序PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因測(cè)序.Blast程序在GenBankTM中對(duì)目的基因序列進(jìn)行相似性檢索分析.

表2　試驗(yàn)所用的引物及其條件Tab.2 PCR primers and conditions used in this study

續(xù)表2　Continue to tab.2

2　結(jié)果與分析

2.1蔬菜樣品附生細(xì)菌中耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果

從10個(gè)蔬菜樣品中提取10份附生細(xì)菌樣品，對(duì)其進(jìn)行6類27種耐藥基因檢測(cè).豬場(chǎng)環(huán)境附生細(xì)菌耐藥基因的攜帶情況見(jiàn)圖1，按耐藥基因的類別計(jì)算，A、B、C、D、F、G、I和J樣品中均檢測(cè)出了上述6類耐藥基因，檢出率100% (6/6).樣品E中檢測(cè)到了5類耐藥基因，檢出率83.33% (5/6)，而樣品H中僅檢測(cè)到了1類耐藥基因，檢出率16.67%(1/6).從耐藥基因的種類數(shù)目計(jì)算，A～J樣品中耐藥基因檢出率分別是77.78% (21/27)、92.59% (25/27)、 92.59%(25/27)、51.85%(14/27)、33.33%(9/27)、92.59%(25/27)、77.78% (21/27)、7.41% (2/27)、81.48%(22/27)和77.78% (21/27).其中，B、C、F樣品的耐藥基因檢出率最高，均為92.59%.從耐藥基因分布范圍來(lái)看(圖1)，喹諾酮類耐藥基因在10個(gè)豬場(chǎng)的蔬菜樣品中均有分布，檢出率100% (10/10)，四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類和β-內(nèi)酰胺類耐藥基因的檢出率均為90% (9 /10)，林可霉素耐藥基因的檢出率為80% (8 /10).由此看出，豬場(chǎng)環(huán)境蔬菜附生細(xì)菌中此6類耐藥基因的分布范圍是非常廣泛的，其中喹諾酮類耐藥基因的分布最為廣泛.

圖1　蔬菜附生細(xì)菌的耐藥基因檢出數(shù)Fig.1 The number of resistance genes in epiphytic bacteria isolated from vegetables

2.2蔬菜樣品內(nèi)生細(xì)菌中耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果

從10個(gè)蔬菜樣品中提取10份內(nèi)生細(xì)菌樣品，對(duì)其進(jìn)行6類27種耐藥基因的檢測(cè).豬場(chǎng)環(huán)境蔬菜內(nèi)生細(xì)菌耐藥基因的攜帶情況見(jiàn)圖2.按耐藥基因的類別計(jì)算，H樣品檢測(cè)出了上述6類耐藥基因，檢出率100%(6/6)，E、F、G樣品分別檢測(cè)到5類耐藥基因，檢出率83.33%(5/6)，D和I樣品分別檢測(cè)到了3類耐藥基因，檢出率50.00%(3/6)，B、C、J樣品檢測(cè)到了2類耐藥基因，檢出率33.33% (2/6)，A樣品未檢出任何種類耐藥基因.按耐藥基因的種類數(shù)目計(jì)算，A～J樣品中耐藥基因的檢出率分別是0(0/27)、11.11% (3/27)、11.11% (3/27)、11.11% (3/27)、29.63% (8/27)、48.15% (13/27)、29.63% (8/27)、33.33%(9/27)、25.93%(7/27)和22.22%(6/27).其中，F(xiàn)樣品中耐藥基因的檢出率最高(48.15%)，高于耐藥基因類別檢出率高的H樣品(33.33%).其次是H、E、G、I、J樣品，檢出率較低的是B、C、D樣品，但均高于A樣品的檢出率(0.00%).對(duì)比蔬菜樣品附生細(xì)菌中的耐藥基因檢出情況，可以看出，蔬菜樣品中附生細(xì)菌(圖1)和內(nèi)生細(xì)菌(圖2)所含的耐藥基因的種類是有差別的，并且附生細(xì)菌中的耐藥基因比內(nèi)生細(xì)菌的豐富.從耐藥基因分布范圍來(lái)看(圖2)，四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因在9個(gè)豬場(chǎng)的蔬菜內(nèi)生細(xì)菌樣品中均有分布，檢出率均為90%(9/10)，氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、林可霉素和喹諾酮類耐藥基因的檢出率分別為50% (5/10)、40%(4/10)、30%(3/10)和30% (3/10).由此看出，四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因的分布范圍是非常廣泛的.對(duì)比附生細(xì)菌中耐藥基因的分布情況，喹諾酮類耐藥基因在附生細(xì)菌中的檢出率為100%(10/10)，而在內(nèi)生細(xì)菌中檢出率為30% (3/10)，可見(jiàn)附生細(xì)菌中喹諾酮類耐藥基因的分布范圍比內(nèi)生細(xì)菌的廣泛.四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因在附生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌的檢出率均為90% (9/10)，其分布范圍是非常廣泛的.

圖2　蔬菜內(nèi)生細(xì)菌的耐藥基因檢出數(shù)Fig.2　 The number of resistance genes in endophytic bacteria isolated from vegetables

3　討論與結(jié)論

本研究中，對(duì)從華南地區(qū)10個(gè)不同豬場(chǎng)采集的地瓜葉、生菜、白菜和蔥等蔬菜中提取的附生和內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行耐藥基因攜帶情況的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，A樣品的附生細(xì)菌中檢測(cè)出了6類耐藥基因，檢出率100% (6/6)，而A樣品的內(nèi)生細(xì)菌中沒(méi)有檢出任何耐藥基因，檢測(cè)率0，H樣品的附生細(xì)菌中只檢測(cè)到1類耐藥基因，檢出率是16.67% (1/6)，而H樣品的內(nèi)生細(xì)菌中檢測(cè)到了6類耐藥基因，檢出率100%(6/6)，這可能與蔬菜對(duì)抗生素的吸收富集能力、其生產(chǎn)環(huán)境污染狀況等因素及附生細(xì)菌、內(nèi)生細(xì)菌所處的環(huán)境不同有關(guān)，內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)具有穩(wěn)定的生存空間，不易受環(huán)境條件的影響，也可能是由于某些細(xì)菌的內(nèi)生性很強(qiáng)，用一般條件根本無(wú)法分離到.Kumar等［13］研究了玉米、洋蔥與卷心菜從施用糞肥的土壤中吸收金霉素與泰樂(lè)菌素的情況，3種作物均可從土壤中吸收金霉素而不吸收泰樂(lè)菌素，說(shuō)明蔬菜對(duì)抗生素的吸收是有選擇性的.在本研究中，附生細(xì)菌中喹諾酮類耐藥基因在10個(gè)豬場(chǎng)的蔬菜樣品中均有分布，檢出率100%(10/10)，其分布范圍是最廣的，這可能與喹諾酮類藥物具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、體內(nèi)分布廣泛等優(yōu)點(diǎn)，而且可以大量地人工合成，在結(jié)構(gòu)上也具有較好的可塑性，在人類和畜牧業(yè)廣泛應(yīng)用有關(guān).朱恒乾等［14］對(duì)廣州分離得到的寵物源(主要是寵物貓、狗)分離株進(jìn)行質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥PMQR基因流行性調(diào)查，檢測(cè)到qnrA、qnrB、qnrD、qnrS和aac(6’) -Ib-cr基因.Hata等［15］在福氏志賀菌Shigella flexneri 2b臨床分離株中發(fā)現(xiàn)了qnrS基因.Jacoby等［16］在肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae中發(fā)現(xiàn)了qnrB基因.岳磊等［17］從廣東地區(qū)獸醫(yī)臨床動(dòng)物源腸桿菌中檢測(cè)到qnrA、qnrB、qnrS基因.Rodriguez-Martinez等［18］從美國(guó)和歐洲人體中以臨床分離株檢測(cè)到了qnrA基因.Wang等［19］從上海人體中以臨床分離株檢測(cè)到了qnrA基因.Wu等［20］從中國(guó)臺(tái)灣人體中以臨床分離株檢測(cè)到qnrA、qnrB、qnrS基因.不同來(lái)源的細(xì)菌都分離到喹諾酮類耐藥基因，說(shuō)明喹諾酮類耐藥基因的分布非常廣泛.

在本研究中，蔬菜附生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌中四環(huán)素類耐藥基因的檢出率較高，說(shuō)明這些細(xì)菌很可能存在嚴(yán)重的耐藥問(wèn)題.這可能是由于長(zhǎng)期施用含四環(huán)素抗生素的糞便作為肥料或者蔬菜吸收了土壤中的抗生素造成的.豬場(chǎng)是四環(huán)素等抗生素使用較為頻繁的地方.吳楠等［21］提取了北京一規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)周邊土壤的微生物DNA，利用普通PCR檢測(cè)到5種四環(huán)素抗性基因(tetB/P、tetM、tetO、tetT、tetW)的存在.鄒世春等［22］采用PCR方法研究了養(yǎng)殖場(chǎng)土壤細(xì)菌DNA中9種四環(huán)素抗性基因的存在和污染水平.結(jié)果表明，所研究的9種四環(huán)素抗性基因中除tetD之外，其他8種抗性基因(tetA、tetB、tetC、tetG、tetL、tetO、tetQ和tetX)均可檢出.Chee-Sanford等［23］采用PCR-DGGE和序列分析技術(shù)在養(yǎng)豬場(chǎng)附近的糞池中檢測(cè)到8種編碼核糖體保護(hù)蛋白(RJPP)的四環(huán)素耐藥基因，分別是tetO、tetQ、tetW、tetM、tetB/P、tetS、tetT 和otrA，在其他許多養(yǎng)殖場(chǎng)如豬場(chǎng)、牛場(chǎng)等的周圍環(huán)境中也常被檢測(cè)到耐藥基因tetW、tetT、tetM、tetO，說(shuō)明這幾種四環(huán)素耐藥基因在養(yǎng)殖場(chǎng)周圍環(huán)境中是廣泛存在的.本試驗(yàn)蔬菜樣品B、C、F、G和J的附生細(xì)菌中分別檢測(cè)到5種四環(huán)素類耐藥基因.Schmitt等［24］通過(guò)PCR方法也證明了土壤中四環(huán)素耐藥基因的多樣性，這與本試驗(yàn)的結(jié)果是一致的.由于不同種類的抗生素對(duì)應(yīng)存在著不同的耐藥基因，而每種抗生素的耐藥基因又有很多種，加上客觀條件(如環(huán)境條件)、檢測(cè)方法等因素的影響，很難將各種耐藥基因進(jìn)行詳細(xì)統(tǒng)計(jì).雖然本試驗(yàn)只基于10個(gè)豬場(chǎng)蔬菜樣品的部分耐藥基因進(jìn)行研究，但從一定程度上證實(shí)了耐藥基因的多樣性以及在動(dòng)物養(yǎng)殖系統(tǒng)與周圍環(huán)境之間傳播的可能性.另外，由于耐藥基因可以整合到一些可移動(dòng)元件(如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等)上，并且能夠在致病菌和非致病菌之間，甚至在革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌之間相互傳播.通過(guò)這種基因橫向轉(zhuǎn)移，耐藥基因很可能通過(guò)食物鏈危及動(dòng)物和人體健康.

本試驗(yàn)調(diào)查了華南地區(qū)10個(gè)不同豬場(chǎng)蔬菜樣品中附生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌的耐藥基因攜帶情況.通過(guò)PCR結(jié)合測(cè)序的方法檢測(cè)氨基糖苷類、四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類和林可霉素共計(jì)6類27種耐藥基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生細(xì)菌中四環(huán)素類耐藥基因的檢出率特別高，附生細(xì)菌攜帶的耐藥基因不論種類還是數(shù)目都比內(nèi)生細(xì)菌的廣泛和豐富.提示豬場(chǎng)蔬菜中附生細(xì)菌耐藥基因攜帶情況已經(jīng)非常嚴(yán)重，應(yīng)給予足夠的關(guān)注和重視.

參考文獻(xiàn):

［1］WITTE W.Medical consequences of antibiotic use in agriculture［J］.Science，1998，279(5353) : 996-997.

［2］MANSON J M，SMITH J M，COOK G M.Persistence of vancomycin-resistant enterococci in New Zealand broilers after discontinuation of avoparcin use［J］.Appl Environ Microbiol，2004，70(10) : 5764-5768.

［3］ANDREWS J H，HARRIS R F.The ecology and biogeography of microorganisms on plant surfaces［J］.Annu Rev Phytopathol，2000，38(1) : 145-180.

［4］CATTOIR V，POIREL L，NORDMANN P.Plasmid-mediated quinolone resistance determinant QnrB4 identified in France in an Enterobacter cloacae clinical isolate coexpressing a QnrS1 determinant［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007，51(7) : 2652-2653.

［5］KIM H B，PARK C H，KIM C J，et al.Prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance determinants over a 9-year period［J］.Antimicrob Agents Chemother，2009，53(2) : 639-645.

［6］NG L K，MARTIN I，ALFA M，et al.Multiplex PCR for the detection of tetracycline resistant genes［J］.Mol Cell Probes，2001，15(4) : 209-215.

［7］AMINOV R I，GARRIGUES-JEANJEAN N，MACKIE R I.Molecular ecology of tetracycline resistance: Development and validation of primers for detection of tetracycline resistance genes encoding ribosomal protection proteins ［J］.Appl Environ Microbiol，2001，67(1) : 22-32.

［8］LINA G，QUAGLIA A，REVERDY M E，et al.Distribution of genes encoding resistance to macrolides，lincosamides，and streptogramins among Staphylococci［J］.Antimicrob Agents Chemother，1999，43 (5 ) : 1062-1066.

［9］DE GRAEF E M，DECOSTERE A，DE LEENER E，etal.Prevalence and mechanism of resistance against macrolides，lincosamides，and streptogramins among Enterococcus faecium isolates from food-producing animals and hospital patients in Belgium［J］.Microb Drug Resist，2007，13(2) : 135-141.

［10］SINGH K V，WEINSTOCK G M，MURRAY B E.An Enterococcus faecalis ABC homologue (Lsa) is required for the resistance of this species to clindamycin and quinupristin-dalfopristin［J］.Antimicrob Agents Chemother，2002，46(6) : 1845-1850.

［11］SUTCLIFFE J，GREBE T，TAIT-KAMRADT A，et al.Detection of erythromycin-resistant determinants by PCR ［J］.Antimicrob Agents Chemother，1996，40 (11) : 2562-2566.

［12］KEHRENBERG C，MEUNIER D，TARGANT H，et al.Plasmid-mediated florfenicol resistance in Pasteurella trehalosi［J］.J Antimicrob Chemother，2006，58(1) : 13-17.

［13］KUMAR K，GUPTA S C，BAIDOO S K，et al.Antibiotic uptake by plants from soil fertilized with animal manure ［J］.J Environ Qual，2005，34(6) : 2082-2085.

［14］朱恒乾，廖曉萍，陳朝喜，等.寵物源大腸桿菌質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥基因流行性檢測(cè)［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43(16) : 3447-3454.

［15］HATA M，SUZUKI M，MATSUMOTO M，et al.Cloning of a novel gene for quinolone resistance from a transferable plasmid in Shigella flexneri 2b［J］.Antimicrob Agents Chemother，2005，49(2) : 801-803.

［16］JACOBY G A，WALSH K E，MILLS D M，et al.qnrB，another plasmid-mediated gene for quinolone resistance ［J］.Antimicrob Agents Chemother，2006，50(4) : 1178-1182.

［17］岳磊，蔣紅霞，劉健華，等.雞源腸桿菌質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥基因檢測(cè)［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(8) : 2966-2971.

［18］RODRIGUEZ-MARTINEZ J M，PASCUAL A，GARCIA I，et al.Detection of the plasmid-mediated quinolone resistance determinant qnr among clinical isolates of Klebsiella pneumoniae producing AmpC-type beta-lactamase［J］.J Antimicrob Chemother，2003，52(4) : 703-706.

［19］WANG M，SAHM D F，JACOBY G A，et al.Emerging plasmid-mediated quinolone resistance associated with the qnr gene in Klebsiella pneumoniae clinical isolates in the United States［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48(4) : 1295-1299.

［20］WU J J，KO W C，TSAI S H，et al.Prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance determinants QnrA，QnrB，and QnrS among clinical isolates of Enterobacter cloacae in a Taiwanese hospital［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007，51(4) : 1223-1227.

［21］吳楠，喬敏，朱永官.豬場(chǎng)土壤中5種四環(huán)素抗性基因的檢測(cè)和定量［J］.生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2009，4(5) : 705-710.

［22］鄒世春，朱春敬，賀竹梅，等.北江河水中抗生素抗性基因污染初步研究［J］.生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2009，4(5) : 655-660.

［23］CHEE-SANFORD J C，AMINOV R I，KRAPAC I J，et al.Occurrence and diversity of tetracycline resistance genes in lagoons and groundwater underlying two swine production facilities［J］.Appl Environ Microbiol，2001，67(4) : 1494-1502.

［24］SCHMITT H，STOOB K，HAMSCHER G，et al.Tetracyclines and tetracycline resistance in agricultural soils: Microcosm and field studies［J］.Microb Ecol，2006，51 (3) : 267-276.

【責(zé)任編輯柴焰】

An investigation of resistance genes in bacteria from vegetables adjacent to the swine farms in Southern China

LIU Zhenzhen，LI Liang，SUN Jian，LIAO Xiaoping，LIU Yahong
(College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University/National Laboratory of
Safety Evaluation (Environmental Assessment) of Veterinary Drugs (SCAU)，Guangzhou 510642，China)

Abstract:【Objective】This experiment was conducted to investigate the resistance genes in bacteria from vegetable samples adjacent to the swine farms in Southern China.【Method】PCR and sequencing were performed to detect the resistance genes of aminoglycoside，tetracycline，beta lactamase，quinolone，macrolide and clindamycin.【Result and conclusion】Tetracycline resistance genes had a wide distribution range (the ground detectable rate of this kind of gene was 90% (9/10) both in accessory bacteria and endophytic bacteria).There were different resistance genes between accessory bacteria and endophytic bacteria from vegetables，and accessory bacteria had richer resistance genes than endophytic bacteria.The detectable rates of resistance genes in accessory bacteria of A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I and J samples were 77.78% (21/27)，92.59% (25/27)，92.59% (25/27)，51.85% (14/27)，33.33% (9/27)，92.59% (25/27)，77.78% (21/27)，7.41% (2/27)，81.48% (22/27) and 77.78% (21/27)，respectively; the detectable rates of resistance genes in endophytic bacteria were 0 (0/27)，11.11% (3/27)，11.11% (3/27)，11.11% (3/27)，29.63% (8/27)，48.15% (13/27)，29.63% (8/27)，33.33% (9/27)，25.93% (7/27) and 22.22% (6/27)，respectively.The results indicatebook=2,ebook=6that the resistance problem in bacteria，especially accessory bacteria from vegetables，is probably very serious.It can even inhibit the growth of crops and threaten animal and human health through food chain to which enough importance should be attached.

Key words:vegetable sample; resistance gene; accessory bacterium; endophytic bacterium; swine farm

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金－廣東省政府聯(lián)合基金(U1201214)

作者簡(jiǎn)介:劉珍珍(1988—)，女，碩士研究生，E-mail: hxzhenzhenliu@ gmail.com;通信作者:孫堅(jiān)(1984—)，男，講師，博士，E-mail: jiansun@ scau.edu.cn

收稿日期:2014-04-11

文章編號(hào):1001-411X(2015) 03-0001-07

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):S852; S859