侯建偉，董曉燕，許日華 （新疆維吾爾自治區(qū)克拉瑪依中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，新疆克拉瑪依834000）

ArraY-CGH技術(shù)在不明原因畸形胎兒檢測(cè)中的應(yīng)用研究

侯建偉，董曉燕，許日華 （新疆維吾爾自治區(qū)克拉瑪依中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，新疆克拉瑪依834000）

目的：探討ArraY-CGH技術(shù)（微陣列比較基因組雜交技術(shù)）在不明原因畸形胎兒檢測(cè)中的應(yīng)用.方法：選取2013－01／2015－10新疆維吾爾自治區(qū)克拉瑪依中心醫(yī)院收治的不明原因畸形胎兒102例作為研究對(duì)象，對(duì)所選胎兒采取CNVs（全基因組拷貝數(shù)變異）進(jìn)行篩查，獲取畸形胎兒不明原因中CNVs檢出率，并分析CNVs與畸形胎兒的相關(guān)性，采用此方法來評(píng)估ArraY-CGH對(duì)不明原因畸形胎兒可能的遺傳病因診斷作用.結(jié)果：25／102例患兒中發(fā)現(xiàn)33個(gè)CNVs（重復(fù)16個(gè)、缺失17個(gè)），總發(fā)生率為32.35%（33／102），CNVs平均長(zhǎng)度1321 kb.對(duì)3／25例患者父母血樣進(jìn)行鑒定，判定CNVs是否是家族遺傳，其中1例具有新生CNVs，余下2例為父親遺傳.攜帶MR／DD致病相關(guān)CNVs的患兒檢出率為15.69%（16／102）.結(jié)論：基因組CNVs相關(guān)的微缺失重復(fù)，是造成不明原因畸形胎兒的原因之一，高分辨ArraY-CGH技術(shù)可在不明原因畸形胎兒中發(fā)現(xiàn)更多的遺傳病因，幫助和提高不明原因畸形胎兒的分子診斷水平.

ArraY-CGH技術(shù)；畸形胎兒；應(yīng)用研究

0 引言

畸形胎兒是指胎兒在子宮內(nèi)發(fā)生的結(jié)構(gòu)或染色體異常.胎兒畸形約占3%.我國(guó)先天殘疾兒童總數(shù)高達(dá)80～100萬，占我國(guó)出生人口總數(shù)的4%～6%.嚴(yán)重的畸形可導(dǎo)致胎兒、新生兒嚴(yán)重殘疾或者死亡［1］.以往常用傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)FISH及MLPA（多重連接依賴探針擴(kuò)增法）等技術(shù)對(duì)畸形胎兒的病因進(jìn)行檢出，但是仍然有一半的患兒無法知道病因.近年隨著微陣列技術(shù)分辨率的不斷發(fā)展，國(guó)外科研人員利用ArraY-CGH技術(shù)對(duì)不明原因畸形胎兒展開CNVs等研究，發(fā)現(xiàn)患兒存在罕見CNVs從而識(shí)別一系統(tǒng)新的微缺失或者重復(fù)綜合癥.本研究選取新疆維吾爾自治區(qū)克拉瑪依中心醫(yī)院收治的102例不明原因畸形胎兒作為研究對(duì)象，采用ArraY-CGH技術(shù)進(jìn)行初步的全基因組CNVs篩查，以此來了解ArraYCGH技術(shù)對(duì)不明原因畸形胎兒可能的遺傳學(xué)病因診斷作用，現(xiàn)報(bào)道如下.

1 資料和方法

1.1 一般資料選取2013－01／2015－10新疆維吾爾自治區(qū)克拉瑪依中心醫(yī)院收治的不明原因畸形胎兒102例作為研究對(duì)象，其中男72例、女30例，年齡0.1～16（平均5.2±1.6）歲.其中伴有生長(zhǎng)落后或發(fā)育遲緩81例、伴有其他畸形或者神經(jīng)系統(tǒng)異常21例，其中患兒具有MR／DD家族史36例、患兒的母親具有異常妊娠史12例、患兒有典型面部特征30例.

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)①母親具有異常妊娠史.②伴發(fā)有其他體表或內(nèi)臟畸形.③異常面容或典型面部特征.④孤獨(dú)癥譜系障礙.⑤患兒發(fā)育遲緩或者生長(zhǎng)落后.（所選患者均滿足上述條件之一）.

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)遺傳代謝性疾病患兒；疑似綜合征患兒；家屬不簽署研究同意書者；均獲兒科研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn).

1.4 診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)不同的年齡段，分別采用《中國(guó)韋氏智力量表》、《兒心0－4歲精神發(fā)育量表》測(cè)定兒童的DQ或IQ，采用《嬰兒－初中生社會(huì)適應(yīng)性能力量表》對(duì)患兒進(jìn)行社會(huì)適應(yīng)性能力評(píng)價(jià).IQ或DQ＜70伴社會(huì)適應(yīng)能力低下診斷為MR，MR（年齡＞5歲），DD（年齡＜5歲）［2］.以下統(tǒng)稱為MR／DD.

1.5 ArraY-CGH技術(shù)檢測(cè)方法QIAGEN抽提外周抗凝血的基因組DNA，獲得吸光度值和濃度后，取3～6 μg DNA于50 μL體系，ALUI和RSAI聯(lián)合37℃消化2 h，之后進(jìn)行NDA純化，重新測(cè)定吸光度值后，取2500 ngDNA，進(jìn)行cy5標(biāo)記對(duì)照標(biāo)本，cy3標(biāo)記MR／DD標(biāo)本，之后終止反應(yīng).將對(duì)照DNA和患兒DNA等量混合后加入雜交體系，94℃變性，37℃0.5 h，上樣到芯片上（oligo 244 k），QIAGEN抽提外周抗凝血的基因組DNA，獲得吸光度值和濃度后，取3～6 μg DNA于50 μL體系，消化2 h，針對(duì)所發(fā)現(xiàn)的罕見CNVs，盡可能采用雙親樣本重復(fù)ArraY-CGH檢測(cè)，了解其是否為新生CNV［3］.

1.6 MR／DD相關(guān)CNVs的評(píng)估方法針對(duì)臨床中發(fā)現(xiàn)的病例，采用國(guó)際基因組CNVs多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，判斷其是否為罕見CNVs或者常見CNVs，參照美國(guó)波士頓兒童醫(yī)院遺傳診斷實(shí)驗(yàn)室的CNVs評(píng)估分析標(biāo)準(zhǔn)將CNVs分為以下5類.①常見類型：≥2例以上片段大小基本完全相同的CNVs或者80%以上區(qū)域完全重疊的相似CNVs.②罕見類型：病例可能和MR／DD相關(guān).③新生類型：正常父母樣本中未發(fā)現(xiàn)，盡管多數(shù)文獻(xiàn)中未詳細(xì)報(bào)道，但也有研究者證明其與MR／DD可能相關(guān)的重要基因.④臨床意義不明確的類型：病例未曾報(bào)道，且其父母未能參與.⑤家族性CNVs：已在正常父母樣本中證實(shí).以上分類②－③均屬于與MM／DD相關(guān)或很有可能相關(guān)的CNVs，對(duì)于此類CNVs，該區(qū)域內(nèi)的基因名稱來自UCSC brower［4］.

2 結(jié)果

2.1 ArraY-CGH檢查結(jié)果25／102例患兒中發(fā)現(xiàn)33個(gè)CNVs（重復(fù)16個(gè)、缺失17個(gè)），總發(fā)生率為32.35%（33／102），CNVs平均長(zhǎng)度1321 kb.

對(duì)3／25例患者父母的血樣進(jìn)行鑒定，判定CNVs是否是家族遺傳，其中1例具有新生CNVs，余下2例為父親遺傳.

25例患兒中33個(gè)罕見CNVs采用美國(guó)波士頓兒童醫(yī)院遺傳診斷實(shí)驗(yàn)室的CNVs的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，并且結(jié)合DECIPHER數(shù)據(jù)庫(kù)和MR／DD相關(guān)研究報(bào)告，發(fā)現(xiàn)20個(gè)CNVs可能與MR／DD有關(guān)系.但是由于部分患兒同時(shí)會(huì)存在兩種情況，16例患兒MR／DD相關(guān)CNVs，因此攜帶MR／DD致病相關(guān)CNVs的患兒檢出率為15.69%（16／102）.這16例患兒中16p11.2微缺失綜合征3例、Pelizaeus-Merzbacher病2例、15q11-13的Prader-Willi綜合征／Angelman綜合征4例、Potocki-Lupsk綜合征6例、16p13.11微缺失綜合征1例.Potocki-Lupsk綜合征.

3 討論

微陣列比較基因組雜交技術(shù)（ArraY-CGH）是一種高分辨率、高通量、高效率的全基因組篩查方法［5］，這一方法有效地克服或彌補(bǔ)了現(xiàn)有染色體檢測(cè)技術(shù)的局限性，將染色體病的診斷提高到亞顯微甚至基因水平上，極大地提高了染色體異常的檢出率［6－7］，為臨床遺傳咨詢醫(yī)師進(jìn)行基因型—表型關(guān)系的分析提供了科學(xué)依據(jù)，用于產(chǎn)前診斷中可有效控制缺陷兒的出生，提高人口素質(zhì)［8－10］.本研究結(jié)果顯示，ArraY-CGH對(duì)MR／DD相關(guān)臨床非典型性綜合征檢出率較高，且對(duì)于部分不明原因畸形胎兒能夠提供準(zhǔn)確的遺傳病因，幫助醫(yī)師判斷患兒的疾病情況.

綜上所述，基因組CNVs相關(guān)的微缺失重復(fù)，是造成不明原因畸形胎兒的原因之一，高分辨ArraYCGH技術(shù)可在不明原因畸形胎兒中發(fā)現(xiàn)更多的遺傳病因，幫助和提高不明原因畸形胎兒的分子診斷水平.

［1］池一嬋.ArraY-CGH技術(shù)在不明原因畸形胎兒檢測(cè)中的應(yīng)用研究［D］.東莞：廣東醫(yī)學(xué)院，2015：251.

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［7］周 靜，蔣 濤，李 璃，等.羊水細(xì)胞染色體核型分析和微列陣比較基因組雜交技術(shù)驗(yàn)證無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)的臨床意義［J］.實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2015，31（4）：292－295.

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Study on the application of ArraY-CGH in the detection of unexplained malformation fetus

HOU Jian-Wei，DONG Xiao-Yan，XU Ri-Hua
Department of Obstetrics and Gynecology，Central Hospital of Karamay，Karamay 834000，China

AIM：To investigate the application of ArraY-CGH（microarray comparative genomic hybridization）in the detection of unexplained malformation fetus.METHODS：A total of 102 unexplained malformation fetus admitted into Central Hospital of Karamay from January 2013 to October 2015 were selected as the objects of research，and they were given CNVs（genome-wide copy number variations）screening to acquire CNVs detection rate of unexplained malformation fetus and analyze the correlations between CNVs and malformation fetus，which could evaluate the diagnosis effect of possible genetic etiology of ArraY-CGH for unexplained malformation fetus.RESULTS：A total of 33 cases of CNVs was found from 25／102（16 repeat，17 missing），and the total incidence rate was 32.35%（33／102），and the average length of CNVs was 1321 kb.The blood sample of 3／25 patients' parents was identificated to determine whether CNVs is family hereditary，of which 1 case had neonatal CNVs，the remaining 2 cases inherited from their father.The children carrying CNVs MR／DD associated with the disease in children with a detection rate of 15.69%（16／102）.CONCLUSION：One reason for unexplained malformation fetus is that relevant duplication and microdeletions of genome CNVs.High resolution ArraY-CGH can find more genetic etiology unexplained malformation fetus and help to improve the molecular diagnosis level of of unexplained malformation fetus.

ArraY-CGH；malformationfetus；application research

R714.53

A

2095-6894（2016）11-37-02

2016－09－07；接受日期：2016－09－20

侯建偉.本科，副主任醫(yī)師.研究方向：產(chǎn)前診斷.Tel：0990-6236053 E-mail：2631072637＠qq.com