陳靖宇，陳鐵龍

1.浙江中醫(yī)藥大學(杭州 310000)，E-mail：532688835@qq.com；2.浙江省杭州市中醫(yī)院

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黃芪甲苷對心肌細胞保護作用的研究進展

陳靖宇1，陳鐵龍2

1.浙江中醫(yī)藥大學(杭州 310000)，E-mail：532688835@qq.com；2.浙江省杭州市中醫(yī)院

摘要：心血管系統(tǒng)疾病是威脅人們生命的重要疾病，其發(fā)生機制較復雜，其中心肌細胞凋亡機制是近年來研究的熱點。對于心肌細胞的保護，黃芪甲苷(As-Ⅳ)起到巨大的作用，它的作用有不同的機制。本研究就As-Ⅳ對心肌細胞的保護作用及機制方面進行相關論述。

關鍵詞：心血管系統(tǒng)疾病；黃芪甲苷；心肌細胞；凋亡；黃芪

黃芪甲苷 (Astragaloside Ⅳ，As-Ⅳ)是中藥材黃芪 (Astragalus membranaceus) 的重要有效化學成分之一[1]。它的主要藥理作用包括增強免疫力、抗炎[2]、抗氧化[3-4]、抗病毒等[5]。近年來，該中藥單體對心血管系統(tǒng)的作用日益受到人們的重視[6]。以As-Ⅳ為主要成分的黃芪注射液主要用于病毒性心肌炎、心力衰竭等[7-8]，提示As-Ⅳ 可能具有類似強心苷類藥物的正性肌力作用。近年來相繼開展了As-Ⅳ在保護心肌細胞方面的研究，包括As-Ⅳ對相關心血管方面疾病的保護作用以及作用的機制，本研究就相關內容作一綜述。

1As-Ⅳ對維持心肌細胞內鈣穩(wěn)態(tài)起作用

龔奧娣等[9]探討As-Ⅳ對心肌缺血心律失常模型大鼠心肌細胞 Ca2+濃度的影響，將心肌缺血再灌注模型大鼠隨機分為模型組和假手術組，各組給藥7 d后開始造模。將 Fura- 2/AM 熒光探針負栽于大鼠心肌細胞，采用熒光分光光度計檢測Ca2+濃度。結果顯示模型組心肌細胞內游離Ca2+濃度與假手術組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與As-Ⅳ的低劑量組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與As-Ⅳ的中、高劑量組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；As-Ⅳ的中、高劑量組與普羅帕酮組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本實驗證明As-Ⅳ可降低心肌細胞內游離Ca2+濃度，從而減少心律失常的發(fā)生，起到抗心律失常的作用。趙美瞇等[10]研究As-Ⅳ對豚鼠心室肌細胞 L型鈣電流和細胞內鈣的影響，分離單個豚鼠心室肌細胞，應用全細胞膜片鉗技術測定鈣電流，并采用熒光顯微鏡CCD成像系統(tǒng)動態(tài)觀察細胞內鈣變化。結果：1×10-6mmol/L As-Ⅳ可明顯抑制L-型鈣通道電流(ICa-L)，使最大電流峰值降低32.6%。As-Ⅳ對60 mmol/L的KCl誘導的[Ca2+]i升高有抑制作用，最大熒光密度變化值從1.17±0.30降至0.26±0.16(P<0.05)。并且As-Ⅳ可直接促進鈣池內鈣釋放，使[Ca2+]i從0.08±0.02升高到0.23±0.07(P<0.05)。從而得出結論：As-Ⅳ抑制 L型鈣通道，可減少細胞外鈣內流；同時它促進內鈣釋放，對心肌細胞內鈣穩(wěn)態(tài)表現(xiàn)為雙向調節(jié)作用。王秋寧等[11]探討As-Ⅳ對異丙腎上腺素(Iso)誘導的乳大鼠心肌細胞肥大的保護作用和機制。實驗方法：將體外培養(yǎng)的乳大鼠心肌細胞分別加入As-Ⅳ3 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L和90 μmol/L孵育30 min后，再加入Iso10 μmol/L作用48 h。另設As-Ⅳ30 μmol/L和Iso30 μmol/L模型對照組。用考馬斯亮藍法測定心肌細胞總蛋白含量；消化分離法及計算機圖像分析系統(tǒng)測量細胞體積；MTT法測定細胞存活率；以Fura-2/AM為熒光探針，采用Till陽離子測定系統(tǒng)，觀察胞內[Ca2+]i瞬間變化。結果與正常對照組相比，As-Ⅳ30 μmol/L對心肌細胞無影響；Iso 30 μmol/L可使心肌細胞總蛋白含量明顯增加，體積明顯增大，心肌細胞內[Ca2+]i瞬間峰值增大，同時使心肌細胞存活率降低了48.1%(P<0.01)。與Iso模型組相比，預加入As-Ⅳ10 μmol/L和30 μmol/L的心肌細胞蛋白質含量明顯降低，As-Ⅳ30 μmol/L組可以恢復達到正常對照組水平；As-Ⅳ 3 μmol/L～90 μmol/L可以拮抗Iso對正常心肌細胞體積增大、細胞內[Ca2+]i瞬間變化幅度增大的作用；As-Ⅳ 3 μmol/L、10 μmol/L和30 μmol/L可顯著升高細胞存活率(P<0.01)。實驗證明As-Ⅳ對Iso誘導的乳大鼠心肌細胞肥大有良好的保護作用，其機制可能與降低細胞內[Ca2+]i有關。

2As-Ⅳ的抗氧化反應

血漿中血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)的活性間接反映心肌細胞膜的完整性和心肌損傷程度的改變[12-13]，LDH、CK-MB含量越高心肌損傷越明顯。心肌組織超氧化物歧化酶(SOD)是心肌組織中清除自由基的酶，而丙二醛(MDA)是脂質過氧化反應生成的活性物質，SOD活性的降低以及MDA的生成增加均可導致心肌細胞的損害。李真真等[14]對As-Ⅳ對大劑量異丙腎上腺素 (Iso)誘導的大鼠心肌梗死的保護作用做了相關研究。用皮下注射大劑量Iso 建立大鼠心肌梗死動物模型，以心電圖ST段抬高值作為心肌缺血指標。行心導管檢查，觀察不同劑量As-Ⅳ對大鼠血流動力學指標的影響；測定LDH、CK-MB含量，SOD 和MDA水平；并且觀察心肌組織形態(tài)學改變。實驗完成后與模型組比較，不同劑量As-Ⅳ均能明顯改善大鼠心肌梗死血流動力學指標(P<0.05或P<0.01)，降低血清LDH、CK-MB含量(P<0.01)，提高心肌組織中SOD活性(P<0.05或P<0.01)，并可減少MDA生成(P<0.01)，減輕心肌細胞的病理形態(tài)學改變。證明As-Ⅳ對Iso 誘導的大鼠心肌梗死有保護作用，并表明As-Ⅳ對梗死心肌大鼠具有清除自由基、減輕脂質過氧化反應的能力，通過清除自由基、減輕脂質過氧化反應產生心肌保護作用。

3As-Ⅳ可以改善心肌能量代謝

線粒體是細胞能量產生和供應的主要場所，其生理功能依賴于內膜的化學電勢，而這個化學電勢是由線粒體膜電位和pH梯度共同構成，其中線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的穩(wěn)定對于維持該化學電勢起主要作用，因此，MMP可以被單獨用來衡量線粒體的產能狀態(tài)。張晶等[15]觀察黃芪甲苷對大鼠腹主動脈縮窄所致心肌肥厚的抑制作用及對心肌能量代謝的影響。使用腹主動脈縮窄法制備大鼠心肌肥厚模型，40只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、黃芪甲苷高劑量組[5 mg/(kg·d)]和低劑量組[1 mg/(kg·d)]，術后1周開始腹腔注射給藥，至12周后處死。檢測大鼠全心質量指數(shù)(HMI)、左心質量指數(shù)(LVMI)；取左心室組織進行HE染色，測量細胞橫徑(TDM)；RT-PCR法檢測心肌組織心鈉素(atrial natriuretic peptide，ANP)mRNA的表達。紫外分光光度法檢測心肌組織中乳酸(IA)和游離脂肪酸(FFA)含有量；激光共聚焦顯微鏡定量檢測線粒體膜電位。結果：與假手術組相比，模型組HMI和LVMI顯著增加，左心室細胞橫徑增加29%，ANP mRNA的表達明顯上調；乳酸與游離脂肪酸含有量顯著升高，MMP下降了39%。與肥厚模型組相比，高劑量黃芪甲苷組大鼠心臟HMI、LVMI下降，TDM明顯降低，明顯下調ANP mRNA的表達；心肌組織乳酸與游離脂肪酸含有量顯著降低，心肌細胞MMP上升了60%。黃芪甲苷低劑量組各項指標改變均無統(tǒng)計學意義?？傊?，高劑量的As-Ⅳ具有抑制心肌肥厚，改善心肌能量代謝的作用。

4As-Ⅳ可以抑制細胞凋亡

鐘飛等[16]探討黃芪甲苷對阿霉素誘導的心肌損傷的保護作用及其機制，雄性SD大鼠分3組：正常組、模型組和黃芪甲苷處理組；除正常組外，其余各組尾靜脈注射阿霉素2.5 mg/kg，隔天1次，共6次，黃芪甲苷處理組同時給予黃芪甲苷30 mg/kg，連續(xù)2周。2周后用BL-420E生物機能實驗系統(tǒng)采集心內壓并分析心功能，檢測心肌組織MDA、SOD和谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活性。常規(guī)病理切片，光鏡觀察，western-blot檢測心肌組織死亡結構域相關蛋白(Daxx)的表達。結果與正常組相比，模型組左室收縮壓(LVSP)、左室內壓最大上升/下降速率(±dp/dtmax)、SOD和GPX活性下降，MDA含量和Daxx表達升高，病理結果顯示：模型組心肌細胞水腫，排列紊亂．纖維斷裂，呈灶性壞死。與模型組相比，黃芪甲苷處理組左室收縮壓(LVSP)、左室內壓最大上升/下降速率、SOD和GPX活性升高，MDA含量和Daxx表達降低，病理結果顯示心肌組織變性壞死顯著減少。結論：黃芪甲苷能改善阿霉素心肌損傷大鼠的心功能，減輕其病理改變，其機制與其清除氧自由基、抑制細胞凋亡等作用有關。近期研究表明As-Ⅳ通過線粒體凋亡通路上PI3K/Akt信號通路的活化對心肌細胞凋亡起抑制作用。多柔比星(DOX)具有心臟毒性，線粒體介導的心肌細胞凋亡在DOX引導的心臟毒性中起決定性作用。DOX對心肌細胞的毒性可以通過增加Bax(促凋亡信號)表達或抑制Bcl-2(抗凋亡信號)表達來激活MAP[由于細胞內活性氧(ROS)過量和三磷酸腺苷(ATP)耗盡使Bax從細胞液移位至線粒體，激活而成]，這減少了Bcl-2與Bax的比例，導致了細胞色素(CytC)的釋放及隨后的Caspase-9與Caspase-3的激活。Jia等[17]研究黃芪甲苷對DOX引導的心肌細胞凋亡的作用，作用對象是原代培養(yǎng)的乳鼠。 免疫細胞化學和MTT分析：黃芪甲苷顯著改善DOX引導的心肌細胞的減少，并通過恢復搏動細胞的比例和心肌細胞的搏動頻率改善心功能。本質上減少了線粒體ROS的產生及LDH、CK-MB、CytC的釋放?；謴土巳姿嵯佘誂TP水平及SDH、ATP合酶活性(DOX引導)。這些表明了黃芪甲苷顯著抑制了DOX引導的線粒體及其功能的破壞。進一步研究表明：通過Hoechst 33258染色的定性分析和流式細胞術的定量分析，黃芪甲苷顯著減少了DOX引導的心肌細胞凋亡率。 Western Blot分析表明：黃芪甲苷通過引導Akt和Bad的磷酸化顯著抑制線粒體凋亡通路的活性，從而恢復Bcl-2與Bax的比率，從而大大減少CytC的釋放及Caspase-9與Caspase-3的激活。而PI3K的抑制劑LY294002顯著抑制黃芪甲苷的抗凋亡作用。因此黃芪甲苷改善DOX引導的心臟毒性的作用必須依靠PI3K/Akt的活化。近期研究表明，As-Ⅳ通過暴露于低氧組織的臍靜脈內皮細胞上的PI3K/Akt通路，成為低氧誘導因子-1a(HIF-1a)和血管生成的一個新的調節(jié)器[18]。而As-Ⅳ通過上調HIF-1a對心肌細胞的凋亡起到抑制作用[19]。

5As-Ⅳ具有抗細胞毒性作用

心肌細胞閏盤超微結構和連接蛋白43對心肌細胞有毒性損傷。姚志勇等[20]通過觀察急性染鎘對大鼠心肌細胞潤盤超微結構和連接蛋白43(Cx43)表達的影響，探討As-Ⅳ的保護機制。將SD大鼠隨機分為正常組、鎘處理組、鎘加As-Ⅳ處理組，取心室肌組織，分別作光鏡、透射電鏡觀察和免疫組化檢測。結果顯示與正常組相比，鎘組心肌細胞連接蛋白43的表達量明顯降低，心肌纖維和閏盤超微結構破壞嚴重；而鎘加As-Ⅳ組心肌細胞連接蛋白43的表達量較鎘組明顯增加，心肌纖維和閏盤超微結構的損傷也明顯減輕。實驗表明鎘能破壞心肌細胞閏盤超微結構，影響連接蛋白43的表達及分布，而As-Ⅳ能在一定程度上拮抗心肌細胞閏盤超微結構和連接蛋白43的毒性損傷。

綜上所述，As-Ⅳ在保護心肌細胞上起到明顯作用，且機制廣泛。對于As-Ⅳ的作用機制，可能還會有更多，對于As-Ⅳ抗細胞凋亡機制方面是近期研究的熱點。

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(本文編輯郭懷印)

(收稿日期：2015-11-19)

中圖分類號：R965R285.5

文獻標識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.09.018

文章編號：1672-1349(2016)09-0980-04