王靈敏，孟小莽，許豫南，孟宇辰

（1.石家莊市種子管理站，河北 石家莊 050051；2.東北林業(yè)大學(xué)國家生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

淺議種子真實(shí)性與品種純度鑒定方法的適用范圍與優(yōu)劣

王靈敏1，孟小莽1，許豫南1，孟宇辰2

（1.石家莊市種子管理站，河北 石家莊 050051；2.東北林業(yè)大學(xué)國家生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

在鑒定品種純度時(shí)，根據(jù)不同品種采用不同方法進(jìn)行真實(shí)性鑒定，對(duì)種子的鑒定工作可以起到事半功倍的效果。筆者總結(jié)了形態(tài)鑒定法、電泳法以及分子標(biāo)記法等幾種鑒定種子純度的方法及適用范圍，并總結(jié)了各方法的優(yōu)劣，供同行參考借鑒。

種子；純度鑒定

品種純度與真實(shí)性是農(nóng)作物種子質(zhì)量重要指標(biāo)之一，品種純度的高低和種子的真假直接影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。

品種純度與種子真實(shí)性鑒定的方法目前有形態(tài)鑒定法、生理生化法以及DNA分子標(biāo)記法。不同作物、不同品種通過選擇適合的方法，可以做到簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快速又準(zhǔn)確。

1 形態(tài)鑒定法

形態(tài)鑒定法包括種子形態(tài)鑒定法、種苗形態(tài)鑒定法和植株鑒定法幾種。

1.1 種子形態(tài)鑒定法

根據(jù)種子形狀、大小、顏色、質(zhì)地及種子外表各部位的特征，鑒別本品種與異品種。如玉米種子可以根據(jù)粒型（馬齒型、半馬齒型、硬粒型）、粒色（白色、黃色、紅色、紫色），籽粒的頂部形狀（長(zhǎng)方、長(zhǎng)圓、圓），頂部顏色以及粉質(zhì)的多少，胚的大小、形狀，胚部皺折的有無、多少，花絲遺跡的位置與明顯程度，稃色、籽粒棱角的有無及明顯程度等進(jìn)行鑒定。

一些玉米雜交品種存在胚乳直感現(xiàn)象，可以用此法鑒別自交粒和雜交種。該法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快速，但用于鑒定品種純度的特征有限，而且適用于形態(tài)性狀豐富且易觀察的作物品種，并且種子的大小、顏色易受成熟度、土壤和氣候的影響，且受主觀影響較大，故準(zhǔn)確性較差，可酌情使用。

1.2 種苗形態(tài)鑒定法

根據(jù)不同品種幼苗的獨(dú)特性狀進(jìn)行鑒定。如玉米芽鞘顏色分為紫色和綠色，用此性狀只適用于鑒別芽鞘顏色不同的玉米品種。該法簡(jiǎn)便、省時(shí)，但僅適用于十字花科、豆科等幼苗形態(tài)性狀豐富的有限幾種作物，而且苗期所依據(jù)的性狀有限，受環(huán)境的影響頗大，測(cè)定結(jié)果不太準(zhǔn)確。

1.3 植株形態(tài)鑒定法

即田間小區(qū)種植鑒定法。田間小區(qū)種植鑒定法是鑒定品種真實(shí)性和測(cè)定品種純度的最為可靠、準(zhǔn)確的方法之一。

為了鑒定品種真實(shí)性，應(yīng)在鑒定的各個(gè)階段與標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行比較，而且為使品種特征特性充分表現(xiàn)，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)和布局上要選擇氣候環(huán)境條件適宜、土壤均勻、肥力一致、前茬無同類作物和雜草的地塊，并有適宜的栽培管理措施。種植株數(shù)要根據(jù)種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)而定，若標(biāo)準(zhǔn)為（N－1）×100%／N，種植株數(shù)應(yīng)為4N。

通常根據(jù)品種審定公告中描述的特征特性，在苗期、花期、成熟期3個(gè)時(shí)期進(jìn)行鑒定，尤其在特征特性表現(xiàn)最明顯時(shí)期必須逐株鑒定。如玉米種子必須在花期根據(jù)株型、株高、葉色、花絲花藥顏色、雄穗分枝等特征特性鑒定。

因依據(jù)的性狀較多，是以前最為通用且比較可靠的方法，但要求有適宜的光照、溫度等氣候環(huán)境條件，如玉米要采用冬季的海南種植鑒定，此法受地域的限制，或者采用當(dāng)?shù)氐耐诜N植鑒定（當(dāng)年所生產(chǎn)的種子要等下一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)才能鑒定），需時(shí)較長(zhǎng)，種子下地前不能鑒定種子優(yōu)劣。

同時(shí)，要求檢驗(yàn)員擁有豐富的經(jīng)驗(yàn)，熟悉被檢品種的特征特性，能正確鑒別植株是屬于本品種還是變異株，并能區(qū)分變異株是遺傳變異，而不是受環(huán)境影響所引起的變異。

另外，如果遭遇冰雹、大風(fēng)、過熱過冷極端天氣及長(zhǎng)期多陰雨天氣難以保證植株正常生長(zhǎng)，就談不上鑒定準(zhǔn)確。

目前一些作物骨干親本的集中頻繁使用，使育成品種間的遺傳差異越來越小，形態(tài)性狀檢驗(yàn)越來越困難。電泳技術(shù)和DNA分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用，恰恰彌補(bǔ)了形態(tài)法的不足。

2 電泳法

電泳法中常用的技術(shù)有同工酶電泳技術(shù)和蛋白質(zhì)電泳技術(shù)。

2.1 同工酶電泳法

利用電泳技術(shù)分離各種酶的同工酶，通過比較同工酶譜，鑒定種子純度。此法能分析大量樣品，較簡(jiǎn)單、快速、可靠，不受環(huán)境影響。

但是，同工酶具有組織特異性、可利用的數(shù)量少、多態(tài)性少，對(duì)酶的提取要求高和電泳條件較為嚴(yán)格，還常因同工酶選擇不當(dāng)、同工酶活性及表達(dá)易隨種子的貯藏和萌發(fā)過程發(fā)生變化等因素，影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，并且因酶易失活，難以大范圍推廣。

2.2 蛋白質(zhì)電泳法

主要包括鹽溶蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳、醋酸尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳和超薄等電聚焦電泳。禾谷類根據(jù)種子醇溶蛋白的多樣性，形成電泳圖譜差異加以鑒別。該方法品種間譜帶差異較為明顯，互補(bǔ)帶清晰、分辨率高，提取和染色時(shí)間較短，簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，穩(wěn)定性、重復(fù)性好，在品種相對(duì)少的時(shí)期，為鑒定種子真實(shí)性和品種純度發(fā)揮了相對(duì)準(zhǔn)確、較為快速的優(yōu)勢(shì)，但對(duì)親緣關(guān)系較近的品種難以鑒別。

醋酸尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定玉米種子的純度，不需要用緩沖液配制分離膠和濃縮膠，簡(jiǎn)化了操作步驟，并且其樣品提取和電泳時(shí)間都比較短，但是也有其局限性，如譜帶彎曲、界限不太清晰等。

超薄等電聚焦電泳技術(shù)采用水平平板電泳槽，凝膠超薄、雙聚焦，大大增加了點(diǎn)樣數(shù)量，操作方便、準(zhǔn)確性高、制膠速度快，縮短了固定、染色和脫色時(shí)間，但是電泳所用的兩性電解質(zhì)價(jià)格較貴。

同工酶電泳技術(shù)和蛋白質(zhì)電泳技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。但其畢竟是基因產(chǎn)物，勢(shì)必會(huì)受到各種環(huán)境因素的影響，而影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 分子標(biāo)記法

分子技術(shù)主要有RFLP技術(shù)、RAPD技術(shù)、AFLP技術(shù)、SSR技術(shù)以及新興的SNP技術(shù)。

3.1 RFLP技術(shù)

利用限制性內(nèi)切酶切割不同品種的DNA時(shí)，產(chǎn)生DNA片段的數(shù)目和大小不同，通過電泳再進(jìn)行Southern轉(zhuǎn)移到膜上，利用放射性同位素，用該探針與支持膜上的DNA雜交得到DNA的限制性片段，多態(tài)性加以區(qū)分。

RFLP標(biāo)記大多數(shù)為共顯性，多態(tài)性穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高，但其過程繁瑣、周期長(zhǎng)、操作難度較大，需要大量純度較高的DNA，耗費(fèi)高，且放射性同位素的使用影響人體安全。這些缺點(diǎn)限制了其推廣應(yīng)用。

3.2 RAPD技術(shù)

利用隨機(jī)引物對(duì)不同品種的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳，得到多態(tài)性DNA譜帶進(jìn)行鑒定。此技術(shù)反應(yīng)靈敏、多態(tài)性強(qiáng)、分辨率高、快速簡(jiǎn)便、無放射性污染、DNA用量極少、成本較低，既有大量的隨機(jī)引物可供篩選之用，又不受種屬的限制。

但RAPD技術(shù)存在提供的信息不夠全、一般為顯性標(biāo)記、不能區(qū)分雜合子與純合子、不同引物之間的擴(kuò)增結(jié)果重復(fù)性和穩(wěn)定性相差較大、引物篩選工作量大等不足，有一定的局限性。

3.3 AFLP技術(shù)

利用基因組DNA經(jīng)酶切后形成大小不等的隨機(jī)限制性DNA片段，片段兩端連接上與酶切位點(diǎn)配對(duì)的特定接頭，用與接頭互補(bǔ)的專用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳、放射自顯影顯示DNA指紋。

AFLP是RFLP和PCR技術(shù)的結(jié)合，兼?zhèn)銻FLP的可靠性和PCR的高效性。但AFLP多態(tài)性檢出率過高，能檢出樣本內(nèi)個(gè)體之間細(xì)微的差異，易形成假雜株，而且對(duì)DNA和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求較高，實(shí)驗(yàn)技能高和儀器設(shè)備精密，操作復(fù)雜，試驗(yàn)周期長(zhǎng)，加之是專利技術(shù)，不宜普及推廣。

3.4 SSR技術(shù)

根據(jù)SSR序列兩端保守的單拷貝序列，設(shè)計(jì)特異的引物，通過PCR擴(kuò)增、電泳，得知不同個(gè)體在某個(gè)SSR座位上的多態(tài)性。

SSR標(biāo)記完全符合作物品種鑒別的4個(gè)基本準(zhǔn)則：環(huán)境的穩(wěn)定性、品種間變異的可識(shí)別性、最小的品種內(nèi)變異性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

但是，對(duì)于品種間沒有位點(diǎn)差異的，誤判為兩個(gè)品種相同；不同平臺(tái)之間不能直接比較，整合需要設(shè)立參照樣品，甚至不同型號(hào)毛細(xì)管電泳儀之間的數(shù)據(jù)也需要進(jìn)行位點(diǎn)的校準(zhǔn)才能實(shí)現(xiàn)互通；毛細(xì)管電泳雖然可以實(shí)現(xiàn)多重，如果要增加通量和引物的數(shù)量，就會(huì)成倍增加工作量，大幅增加檢測(cè)成本。

3.5 SNP標(biāo)記技術(shù)

SNP標(biāo)記是在基因組上單個(gè)核苷酸的變異形成的遺傳標(biāo)記。此法標(biāo)記密度高，與功能基因的關(guān)聯(lián)度高，更容易開發(fā)到與性狀相關(guān)的SNP功能標(biāo)記，遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)，檢測(cè)通量高，易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析。SNP標(biāo)記一般只有兩種等位基因型，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)簡(jiǎn)單，且不依賴檢測(cè)平臺(tái)，容易實(shí)現(xiàn)不同來源數(shù)據(jù)的整合和標(biāo)準(zhǔn)化。

我國在農(nóng)作物DNA鑒定指紋研究發(fā)展較快，特別是在主要農(nóng)作物品種DNA分子檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化和應(yīng)用方面。在GB/T3543.5-1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程真實(shí)性和品種純度鑒定》第1號(hào)修改單中，增加6.2.4條即DNA分子檢測(cè)方法：品種真實(shí)性驗(yàn)證或身份鑒定，允許采用SSR和SNP分子標(biāo)記方法。

截至2014年6月底，現(xiàn)行有效的農(nóng)作物分子檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有18項(xiàng)，涉及15類農(nóng)作物。如NY/T 1432-2014、NY/T 2470-2013、NY/T 2595-2014、NY/T 2469-2013、NY/T 1433-2014，即玉米、小麥、大豆、陸地棉和水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法等。同時(shí)，新種子法第四十七條規(guī)定“：農(nóng)業(yè)、林業(yè)主管部門可以采用國家規(guī)定的快速檢測(cè)方法對(duì)生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)的種子品種進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果可以作為行政處罰依據(jù)”，這為種子質(zhì)量監(jiān)督及時(shí)到位提供了法律依據(jù)，也更加速了SSR標(biāo)記法的推廣應(yīng)用，在種子質(zhì)量管理上發(fā)揮越來越重要的作用，為打擊假冒偽劣種子，保護(hù)育種者、種子生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)企業(yè)和農(nóng)民的合法權(quán)益提供重要的技術(shù)保障。

1005-2690（2016）08-0033-02

：S339.36+1

：A

2016-07-21）

王靈敏(1986-），女，河北石家莊人，本科，高級(jí)農(nóng)藝師，從事種子質(zhì)量監(jiān)督與種子管理工作。