南子晴 華春珍 王曉芳 龐福珍

●臨床研究

肺炎支原體肺炎患兒急性期和恢復(fù)期血漿H-ficolin和L-ficolin水平分析

南子晴 華春珍 王曉芳 龐福珍

目的 了解肺炎支原體肺炎患兒急性期和恢復(fù)期血漿中H-ficolin、L-ficolin水平的變化。方法 采用ELISA法檢測(cè)85例肺炎支原體肺炎患兒急性期和恢復(fù)期血漿H-ficolin、L-ficolin水平，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果 急性期H-ficolin水平1.8～25.2μg/ml，平均（11.9±5.9）μg/ml，恢復(fù)期H-ficolin水平0.3～26.5μg/ml，平均（10.1±5.7）μg/ml，急性期明顯高于恢復(fù)期（Z=2.161，P=0.031）。急性期L-ficolin水平0.2～10.6μg/ml，平均（4.5±2.3）μg/ml，恢復(fù)期L-ficolin水平0.03～10.2μg/ml，平均（4.6±2.2）μg/ml，急性期和恢復(fù)期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=0.245，P=0.807）?；純杭毙云谘獫{H-ficolin水平與L-ficolin水平明顯相關(guān)（r=0.22，P=0.039）。結(jié)論 H-ficolin可能參與兒童肺炎支原體肺炎疾病過(guò)程。

肺炎支原體 肺炎 兒童 H-ficolin L-ficolin

肺炎支原體（mycoplasma pneumonia，MP）是引起兒童呼吸道感染的常見病原。近年來(lái)，肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）逐漸成為兒童社區(qū)獲得性肺炎的重要類型之一，MPP患兒除可有反復(fù)咳嗽、發(fā)熱等癥狀外，也可伴發(fā)心肌炎、腦膜炎、腎炎等多系統(tǒng)的肺外并發(fā)癥[1]。研究表明，MPP能引起機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫功能紊亂，激活補(bǔ)體系統(tǒng)造成肺內(nèi)外免疫損傷和炎性損傷[2]。補(bǔ)體系統(tǒng)在體內(nèi)參與機(jī)體抗微生物防御反應(yīng)，亦介導(dǎo)免疫病理的損傷性反應(yīng)[3]。已發(fā)現(xiàn)糖類模式識(shí)別分子Ficolin（包括H-ficolin和L-ficolin）能識(shí)別病原體表面的病原相關(guān)模式分子并與之結(jié)合，激活MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶，從而啟動(dòng)凝集素途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)，因此推測(cè)MPP患兒血漿中H-ficolin和L-ficolin可能存在含量的變化。本研究觀測(cè)了杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院兒科住院的85例MPP患兒血漿中H-ficolin和L-ficolin在急性期和恢復(fù)期水平的變化，探究其在MPP發(fā)病中的可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2012年7月至2013年6月杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院兒科收治的MPP患兒85例，其中男50例（58.8%），女35例（41.2%），男女比例1.43∶1。年齡11個(gè)月～14歲，平均（6.3±3.2）歲，其中0～1歲1例（1.2%），＞1～3歲17例（20.0%），＞3～6歲28例（32.9%），＞6～14歲39例（45.9%）；4歲以上學(xué)齡前期和學(xué)齡期兒童共67例（78.8%）。所有患兒均有咳嗽癥狀，78例反復(fù)發(fā)熱，其中高熱62例，中等度發(fā)熱13例，低熱3例，熱程1～21（6.7±3.1）d。所有患兒X線胸片均有斑片狀或大片狀密度增高影。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) （1）符合中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部2012年9月3日發(fā)布的衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS382-2012肺炎的診斷；（2）恢復(fù)期MP IgG滴度較急性期上升4倍以上；（3）痰液或咽拭子MP-DNA陽(yáng)性。本研究的恢復(fù)期界定為體溫正常，咳嗽癥狀明顯減輕2d后，或X線胸片提示陰影明顯吸收。

1.3 試劑和儀器 人H-ficolin ELISA試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：12504K0113-K）和L-ficolin ELISA試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：11096K1112-G）為荷蘭Hycult Biotech生物技術(shù)公司產(chǎn)品。測(cè)定儀器為Molecular device公司的酶標(biāo)儀。EDTA抗凝管為浙江康是醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品。

1.4 方法 所有研究對(duì)象于入院時(shí)及經(jīng)治療后恢復(fù)期采集靜脈血1.5ml，室溫靜置1h后，2 000×g室溫離心15min，分離血漿，分裝2管，每管200μl，置-70℃冰箱保存待用。檢測(cè)時(shí)，標(biāo)本室溫復(fù)溫并經(jīng)漩渦振蕩混勻標(biāo)本。血漿H-ficolin和L-ficolin檢測(cè)采用ELISA法以復(fù)孔完成，檢測(cè)H-ficolin時(shí)樣本以1∶40稀釋，檢測(cè)L-ficolin時(shí)標(biāo)本以1∶20稀釋。具體操作如下：按照要求稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣本，每孔加入100μl，室溫（L-ficolin試劑盒37℃）孵育1h；洗滌4次后每孔加入示蹤劑100μl，室溫孵育1h；洗滌4次后每孔加入100μl鏈酶親和素過(guò)氧化物酶，室溫孵育1h，洗滌后每孔加入100μ TMB底物顯色，室溫孵育30min，再在每孔加入100μl終止液中止反應(yīng)并經(jīng)酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處讀數(shù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)得出待測(cè)樣品中H-ficolin和L-ficolin含量。MPP患兒急性期與恢復(fù)期抽血時(shí)間間隔2～11d，平均（5.5±1.7）d。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，正態(tài)分布計(jì)量資料采用表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney檢驗(yàn)）；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。

2 結(jié)果

2.1 臨床治療和結(jié)果 所有患兒均治愈出院，住院時(shí)間為 4～17（9.3±2.2）d。其中阿奇霉素治愈 80例（94.1%），紅霉素治愈2例（2.4%），阿奇霉素治療效果欠佳，后改紅霉素治療治愈3例（3.5%）。曾采用甲基強(qiáng)的松龍靜脈滴注16例（18.8%），所有患兒均未采用丙種球蛋白注射。

2.2 MPP患兒急性期和恢復(fù)期血漿H-ficolin、L-ficolin水平比較 研究總體急性期血漿H-ficolin水平明顯高于恢復(fù)期（Z=2.161，P=0.031）；急性期和恢復(fù)期男性和女性患兒血漿H-ficolin水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Z= 0.335、0.746，均P＞0.05）；研究總體急性期和恢復(fù)期血漿L-ficolin水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=0.245，P＞0.05）；急性期和恢復(fù)期男、女患兒血漿L-ficolin水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=1.081、0.090，均P＞0.05）。

2.3 相關(guān)性分析 患兒急性期和恢復(fù)期血漿H-ficolin水平與年齡無(wú)明顯相關(guān)（r=0.158、0.048，P=0.149、0.665）；患兒急性期和恢復(fù)期血漿L-ficolin水平與年齡無(wú)明顯相關(guān)（r=0.105、0.066，P=0.342、0.550）。急性期患兒血漿H-ficolin水平與L-ficolin水平明顯相關(guān)（r=0.22，P=0.039），但恢復(fù)期兩者之間相關(guān)性不明顯（r=0.032，P=0.768）。

3 討論

MPP的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，免疫學(xué)機(jī)制被認(rèn)為占有重要的地位。研究表明，MPP患者熱程長(zhǎng)，病情重，肺部實(shí)變嚴(yán)重，伴多系統(tǒng)肺外系統(tǒng)癥狀的患者IgG、IgM、IgA等體液免疫指標(biāo)上升明顯，提示免疫因素是在MPP發(fā)病中起重要作用[4]。本組MPP患兒主要為4歲以上學(xué)齡前期和學(xué)齡期兒童，即為免疫系統(tǒng)相對(duì)完善的兒童，免疫損害也較容易發(fā)生。

Ficolin是一組存在于脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)，組織分布廣泛的凝集素蛋白[5]，最早由Ichijo等[6-7]從豬子宮內(nèi)膜中作為TGF-β結(jié)合蛋白分離出來(lái)，與甘露聚糖結(jié)合凝集素（mannose binding lectin，MBL）具有類似的結(jié)構(gòu)和功能，有膠原蛋白樣區(qū)和纖維蛋白樣區(qū)。血漿中的Ficolin可結(jié)合病原體表面的糖類配體，通過(guò)調(diào)理吞噬作用及凝集素途徑激活補(bǔ)體，是天然免疫中的效應(yīng)分子[8]。已發(fā)現(xiàn)，人Ficolin有3種：M-ficolin(又稱ficolin-1，ficolin/p35相關(guān)蛋白)、L-ficolin（又稱ficolin-2，p35，Hucolin或EBP-35）和H-ficolin（又稱ficolin-3，Hakata antigen）[9]。前者為主要表達(dá)于肺和單核細(xì)胞膜表面的相關(guān)蛋白，血清中含量很低，而后兩者是血清蛋白，主要存在于血清中[10]。目前國(guó)內(nèi)罕有關(guān)于人血清Ficolin水平的研究，本組MPP患兒急性期和恢復(fù)期血漿H-ficolin和L-ficolin水平的定量檢測(cè)結(jié)果，一定程度上反應(yīng)了兒童中血漿H-ficolin和L-ficolin水平，為今后同類研究提供一定參考。

H-ficolin和L-ficolin均有抗感染功能，其機(jī)制主要由兩個(gè)方面：一是能識(shí)別病原體表面的病原相關(guān)模式分子并與之結(jié)合激活MBL相關(guān)的絲氨酸蛋白酶，進(jìn)而裂解補(bǔ)體產(chǎn)生C3b、C4b等調(diào)理素，以促進(jìn)吞噬細(xì)胞內(nèi)吞作用；二是直接與吞噬細(xì)胞表面的Ficolin特異性受體結(jié)合，從而拉近了病原體與吞噬細(xì)胞之間的距離，利于病原體被吞噬和清除[8]。H-ficolin主要在肝臟和肺中表達(dá)，且在肺中表達(dá)大于其他組織，其啟動(dòng)凝集素途徑能力強(qiáng)于L-ficolin和M-ficolin，并證實(shí)H-ficolin具有耐細(xì)菌膠原酶的特性[11]。L-ficolin主要在肝臟中表達(dá)，與肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等細(xì)菌結(jié)合活性較強(qiáng)[12]，在體內(nèi)外能結(jié)合糖蛋白、血凝素和神經(jīng)氨酸酶，能抑制流感病毒[13]。本組為MPP患兒，急性期血漿H-ficolin水平顯著高于恢復(fù)期，考慮與MPP患兒組織炎性損傷主要限于肺部有關(guān)，MP感染肺部可能刺激了H-ficolin的表達(dá)從而利于病原體被調(diào)理吞噬而清除，至于是否通過(guò)與MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶激活補(bǔ)體，有待體外結(jié)合活性鑒定及補(bǔ)體凝集素途徑關(guān)鍵組成研究以明確機(jī)制。此外，本研究中有16例患兒用過(guò)甲基強(qiáng)的松龍，可能對(duì)ficolin的表達(dá)有一定影響。在激活補(bǔ)體的凝集素組分中，H-ficolin是最有效的補(bǔ)體活化劑，而L-ficolin和MBL激活補(bǔ)體的能力只有H-ficolin的一半[14]，本組L-ficolin在血漿中表達(dá)穩(wěn)定，在MPP患兒急性期和恢復(fù)期無(wú)明顯差異，可能與L-ficolin和MP結(jié)合活性低或受H-ficolin觸發(fā)的補(bǔ)體激活中間產(chǎn)物抑制而不能充分誘導(dǎo)補(bǔ)體激活有關(guān)，該推測(cè)也有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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（本文編輯：沈昱平）

《浙江醫(yī)學(xué)》對(duì)圖表的要求

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本刊編輯部

Serum H-ficolin and L-ficolin levels in children with Mycoplasma pneumoniae pneumonia

NAN Ziqing，HUA Chunzhen，WANG Xiaofang，et al.Department of Pediatrics，the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University，Hangzhou 310015,China

Objective To determine serum H-ficolin and L-ficolin levels in children with Mycoplasma pneumoniae pneumonia(MPP). Methods The levels of serum H-ficolin and L-ficolin at acute and convalescent stages were determined by ELISA in 85 children with MPP. Results The mean H-ficolin level at the acute stage was (11.9±5.9)μg/ml(1.8～25.2μg/ml), which was significant higher than that at the convalescent stage(10.1±5.7)μg/ml(0.3～26.5μg/ml,Z=2.161,P=0.031).The mean L-ficolin levels at the acute stage and convalescent stage was (4.5±2.3)μg/ml(0.2～10.6μg/ml)and (4.6±2.2)μg/ml (0.03～10.2μg/ml),respectively(t=0.245,P=0.807).In acute stage serum H-ficolin level was correlated with L-ficolin level(r=0.22, P=0.039). Conclusion H-ficolin may be involved in the disease process in Mycoplasma pneumonia in children.

Mycoplasma pneumonia Pneumonia Children H-ficolin L-ficolin

2014-06-04）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011KY A128）；杭州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011A020）

310015 杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院兒科（南子晴、華春珍、王曉芳，華春珍現(xiàn)在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院工作）；天臺(tái)縣人民醫(yī)院兒科（龐福珍）

華春珍，E-m ai l：chunzhenhua@yahoo.com