羅在柒﹡，顏鳳霞，田 凡

（貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴州 貴陽(yáng) 550005）

核桃優(yōu)良無(wú)性系組培初代培養(yǎng)條件探索

羅在柒﹡，顏鳳霞，田 凡

（貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴州 貴陽(yáng) 550005）

主要對(duì)核桃優(yōu)良無(wú)性系初代培養(yǎng)外植體材料選擇、消毒方法和培養(yǎng)條件進(jìn)行探索，結(jié)果表明，核桃組培最佳外植體采集為3—6月份的莖尖，消毒方法應(yīng)盡可能簡(jiǎn)便、快速，培養(yǎng)條件需經(jīng)過(guò)低溫暗培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)果可為核桃良種組培開(kāi)繁提供借鑒。

核桃；組織培養(yǎng)；外植體選擇；消毒方法；培養(yǎng)條件

植物組培技術(shù)是工廠化生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的現(xiàn)代生物技術(shù)，也是快速繁殖植物新品種最主要的方法。迄今為止，植物組培技術(shù)在植物離體快繁、無(wú)病毒苗木培育、遺傳育種及種質(zhì)資源保存等方面都取得了顯著成績(jī)。GaleMcGranahan等報(bào)道，核桃成年品種離體繁殖已獲成功，并已進(jìn)行生產(chǎn)試驗(yàn)[1]。樊靖等報(bào)道了以5個(gè)核桃品種 (株系)10年生植株的莖段為外植體進(jìn)行的離體培養(yǎng)和植株再生研究[2]。在核桃種胚的離體培養(yǎng)方面國(guó)內(nèi)外學(xué)者也做了大量研究。優(yōu)良無(wú)性系核桃組培由于樹(shù)體本身富含多酚物質(zhì)，易發(fā)生褐化，初代培養(yǎng)難度大。本文主要進(jìn)行核桃優(yōu)良無(wú)性系初代培養(yǎng)外植體材料選擇、消毒方法和培養(yǎng)條件的探索，以期對(duì)核桃無(wú)性系組培提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

核桃優(yōu)良無(wú)性系為黔林核1號(hào)（Juglans sigillata“qianlinhe-1”），1973年在牛棚初選，入選省級(jí)優(yōu)樹(shù)，1981—1990年進(jìn)行無(wú)性系品比試驗(yàn)，篩選為優(yōu)樹(shù)，1985年命名為早熟露仁核桃，作為大面積推廣的主栽品種。材料來(lái)源于貴州省林科院采穗圃。

1.2 方法

1.2.1 外植體選擇

通過(guò)采集越冬頂芽和腋芽、萌動(dòng)期頂芽和腋芽、快速生長(zhǎng)期（半木質(zhì)化）頂芽和腋芽等材料，分不同批次消毒和接種，材料大小以莖段長(zhǎng)度為計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)置1～4cm，對(duì)比統(tǒng)計(jì)不同時(shí)期外植體材料以及材料的大小在核桃組培過(guò)程中褐化和生長(zhǎng)情況。

1.2.2 消毒與抑制物質(zhì)篩選

消毒分為常規(guī)處理和新型消毒劑“山農(nóng)I號(hào)”作對(duì)比。常規(guī)處理用自來(lái)水沖洗材料30 min；用洗潔凈清洗材料，若大田材料污染較重，可以用軟毛刷輕輕刷洗莖段和葉片，然后用自來(lái)水沖洗干凈；用濾紙吸干其表面水分；置于2%硫代硫酸鈉溶液中浸泡20～30min；用蒸餾水沖洗4～5次。山農(nóng)I號(hào)，將外植體按要求枝剪后置于消毒液3min，直接接入培養(yǎng)基。抑制物質(zhì)以活性炭、PVP（聚乙烯吡咯烷酮Polyvinyl pyrrolidone）等做對(duì)比試驗(yàn)，即每升培養(yǎng)基中添加1.5g活性炭和3.0gPVP，能有效抑制外植體褐化。

1.2.3 外植體培養(yǎng)

通過(guò)對(duì)照低溫暗培養(yǎng)、常溫暗培養(yǎng)和正常培養(yǎng)條件。正常培養(yǎng)條件白天溫度為25±3℃，夜間溫度為18±2℃，光照時(shí)間15h/d，光照強(qiáng)度2 000 lx，初代供試培養(yǎng)基均為改良DKW+BA1.0mg/L+IBA0.01mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體材料篩選，獲得脫毒有效外植體材料

不同時(shí)期采集外植體材料培養(yǎng)結(jié)果得到：越冬頂芽和腋芽雖然污染率高，但易于生長(zhǎng)，黃化現(xiàn)象嚴(yán)重；萌動(dòng)期頂芽和腋芽主要特點(diǎn)為褐化嚴(yán)重，外植體停止生長(zhǎng)，其污染率低；快速生長(zhǎng)期（半木質(zhì)化）頂芽褐化相對(duì)嚴(yán)重，污染率相對(duì)高，腋芽能較好萌發(fā)，但脫離母體后停滯生長(zhǎng)。

通過(guò)外植體材料生物量大小試驗(yàn)結(jié)果得到，核桃組培必須盡量增大外植體生物量，即外植體材料控制在4.0 cm左右，才能保證緩解外植體褐化，獲得有效脫菌無(wú)性系材料。

核桃組培最佳外植體為3—6月份的莖段，且莖段的芽較粗壯，約為0.3～0.5 cm，莖部木質(zhì)化程度不高的莖段萌芽率高。

2.2 外植體消毒方法的篩選

消毒方法的篩選主要是以控制外植體褐化，或者抑制啟動(dòng)褐化物質(zhì)產(chǎn)生為原則，盡可能使消毒時(shí)間短、步驟少。通過(guò)試驗(yàn)得到應(yīng)用過(guò)新型消毒劑，即“山農(nóng)I號(hào)”消毒液能較好實(shí)現(xiàn)消毒效果，比常規(guī)試劑如氯化汞、酒精等消毒效果更好。

2.3 抑制外植體褐化物質(zhì)的篩選

基本培養(yǎng)基篩選。通過(guò)試驗(yàn)，在培養(yǎng)基中降低硝基鹽濃度，能緩解褐化發(fā)生，DKW培養(yǎng)基優(yōu)于MS培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中添加活性炭、PVP等物質(zhì)能有效緩解外植體褐化，即每升培養(yǎng)基中添加1.5 g活性炭和3.0 gPVP能有效抑制外植體褐化。 增加繼代頻次能使培養(yǎng)基多酚物質(zhì)與外植體分開(kāi)，一定程度上減少對(duì)外植體的傷害。外植體接種后，3～5 d內(nèi)每天更換一次培養(yǎng)基，可以得到理想的效果。

2.4 培養(yǎng)條件的篩選

外植體接種后置于4℃冰箱暗培養(yǎng)3 d后，再繼續(xù)置于組培室中培養(yǎng)，有益于防治褐化的發(fā)生。尤其注意在拿出冰箱后第二天開(kāi)始出現(xiàn)輕度的褐化現(xiàn)象，接著第3、4天，褐化會(huì)加劇且污染莖段亦呈現(xiàn)，需及時(shí)處理。在第15天左右，會(huì)出現(xiàn)萌芽現(xiàn)象。萌芽后再轉(zhuǎn)接培養(yǎng)很容易污染、長(zhǎng)霉菌，特別是在長(zhǎng)葉后更容易長(zhǎng)菌污染且容易出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，所以每隔3～5 d需轉(zhuǎn)接一次。

3 結(jié)論

外植體應(yīng)選擇在3—6月核桃快速生長(zhǎng)季的莖段，外植體材料盡可能粗壯，長(zhǎng)度在4 cm左右為宜；消毒方法盡可能快捷，避免對(duì)外植體傷害，接種后經(jīng)4℃低溫暗培養(yǎng)3 d轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)。接種初期增加繼代次數(shù)更換培養(yǎng)基，有益于防治褐化的發(fā)生。

[1]McGranahanGH.etal.In vitro propagation of mature Persianwalnut cultivars[J].Hortsci. 1988,28(1):220.

[2]樊靖,劉慶忠,張俊林，等.核桃離體培養(yǎng)和

植株再生[J].2009,36(6):867-872.

1005-2690（2016）12-0104-02

S664.1

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貴州省林業(yè)科研課題編號(hào)：黔林科合J字[2012]03號(hào)