韓知忖劉 冰周 輝

人參皂苷Rg1對神經(jīng)細(xì)胞衰老和衰老相關(guān)異染色質(zhì)聚集的影響

韓知忖1劉 冰2周 輝3

目的探討人參皂苷Rg1預(yù)處理對三丁基過氧化氫（t-BHP）誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞衰老及異染色質(zhì)聚集（SAHF）的影響。方法常規(guī)培養(yǎng)Neuro-2a細(xì)胞株，在造模藥物刺激前，給予不同劑量的人參皂苷Rg1，同時(shí)設(shè)置模型對照組、正常對照組。進(jìn)行細(xì)胞活力檢測、衰老相關(guān)半乳糖苷酶染色、衰老相關(guān)異染色質(zhì)聚集檢測。結(jié)果人參皂苷Rg1預(yù)處理可改善t-BHP誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低，此改善呈劑量依賴性；人參皂苷Rg1預(yù)處理各組，SA-β-gal染色細(xì)胞陽性數(shù)呈劑量依賴性降低；人參皂苷Rg1預(yù)處理可預(yù)防t-BHP誘導(dǎo)的SAHF形成，呈顯著劑量依賴性。結(jié)論人參皂苷Rg1預(yù)處理可劑量依賴性地預(yù)防神經(jīng)細(xì)胞衰老，防止異染色質(zhì)聚集，有必要進(jìn)一步研究。

Neuro-2a細(xì)胞；人參皂苷Rg1；細(xì)胞衰老；衰老相關(guān)異染色質(zhì)聚集

隨著老齡化不斷推進(jìn)，以帕金森病和阿爾采默病為代表的衰老相關(guān)神經(jīng)變性疾病的發(fā)病率及致殘率逐年升高[1]。細(xì)胞衰老（cellular senescence）參與帕金森病、阿爾采默病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展，并與氧化應(yīng)激、端?？s短等因素有關(guān)[2]。本文采用三丁基過氧化氫（t-BHP）制備Neuro-2a細(xì)胞衰老模型，考察人參皂苷Rg1預(yù)處理對神經(jīng)細(xì)胞衰老及衰老相關(guān)異染色質(zhì)聚集的影響，為闡明人參皂苷Rg1抗衰老機(jī)制提供可靠的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑 Neuro-2a（N2a）細(xì)胞株(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，批號YM-CS0050）；MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Hyclone公司，批號SH30022.01B）；FBS胎牛血清（GIBCO公司，批號16400-044）；雙抗（北京夏斯生物科技有限公司，批號SV30010）；t-BHP（阿拉丁，批號B106035-1L）；CCK8檢測試劑盒（Dojindo公司，批號 CK04）；SA-β-gal檢測試劑盒（Cell Signaling，批號9860）；H3K9me3抗體（Abcam，批號ab8898）；4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司，批號P1110）；PBS（北京索萊寶科技有限公司，批號SH30256）；正常羊血清封閉液（北京索萊寶科技有限公司，批號SL2-10）；新鮮配制的3%H2O2；Triton X-100（Sigma，批號T9284）；人參皂苷Rg1（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，批號YM635B）；低速離心機(jī)（上海貝恩生物科技有限公司，批號TDZ4B-WS）；CO2培養(yǎng)箱（上海博訊，批號BC-J160S）；超凈工作臺（上海博訊，型號SW-CJ-2FD）；酶標(biāo)儀（Thermo，型號MULTISKAN MK3）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 參照文獻(xiàn)[3]方法，取N2a細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，分6組處理如下：空白對照組：僅傳代6代，不給予t-BHP處理；模型對照組：傳代6代后，以100μMt-BHP處理；人參皂苷Rg1預(yù)處理4組：分別以 5μMRg1+100μMt-BHP、10μMRg1+100μMt-BHP、20μMRg1+100μMt-BHP、40μMRg1+100μMt-BHP處理，各組以相應(yīng)濃度的Rg1EMEM培養(yǎng)N2a細(xì)胞，傳代6代后用t-BHP處理4次，隔代作用1次，每次1h，末次作用后，換新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)24～48h后收獲細(xì)胞。

1.2.2 CCK-8檢測 參照文獻(xiàn)[4]方法，取各組細(xì)胞，以5×103/孔的密度鋪入96孔板內(nèi)，每孔加培養(yǎng)液至終體積100μL，作用24h、48h、72h后，每孔加入10μL CCK-8反應(yīng)液，孵育1～4h，用酶標(biāo)儀在450nm處測定吸光度。

1.2.3 SA-β-gal染色 參照文獻(xiàn)[5]方法，在六孔板中預(yù)先置入已鋪多聚賴氨酸的1.8cm×1.8cm玻璃蓋片，取各組細(xì)胞，按700/cm2的細(xì)胞密度接種，常規(guī)培養(yǎng)24h，次日取出蓋片，用4℃ PBS沖洗細(xì)胞2次，4℃ 2%甲醛0.2% 戊二醛固定5min，PBS沖洗細(xì)胞2次；用SA-β-gal反應(yīng)液37℃孵育3～4h，然后用雙蒸水沖洗2次，后固定4min；沖洗，核固紅染色細(xì)胞核，脫水，透明，封固。光學(xué)顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)。

1.2.4 衰老相關(guān)異染色質(zhì)聚集（senescence-associated heterochromatic foci，SAHF）檢測 參照文獻(xiàn)[6]方法，在六孔板中預(yù)先置入已鋪多聚賴氨酸的1.8cm× 1.8cm玻璃蓋片，取各組細(xì)胞，按700/cm2的細(xì)胞密度接種，常規(guī)培養(yǎng)24h，次日取出蓋片，用4℃ PBS沖洗細(xì)胞2次，4℃ 4%甲醛固定15min，0.1%Triton X-100處理切片15min，使細(xì)胞固定且通透性增加，用PBS沖洗玻片，再用10%的胎牛血清封閉30min，然后滴加一抗（H3K9me3），常溫孵育1h，PBS沖洗，滴加熒光二抗，常溫孵育2～3h，PBS沖洗，加入DAPI染液復(fù)染，反應(yīng)5min，PBS浸泡5min，清洗，晾干，加防淬滅樹膠，激光共聚焦顯微鏡下觀察H3K9me3在細(xì)胞核中的分布，以考察人參皂苷Rg1預(yù)處理對SAHF形成的影響。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)胞活力 CCK-8檢測結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1預(yù)處理可改善t-BHP誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低，且此種改善呈劑量依賴性，見圖1（封四）。

2.2 SA-β-gal染色 人參皂苷Rg1預(yù)處理各組，SA-β-gal染色細(xì)胞陽性數(shù)呈劑量依賴性降低，見圖2（封四）。

2.3 SAHF形成 人參皂苷Rg1預(yù)處理可預(yù)防t-BHP誘導(dǎo)的SAHF形成，呈顯著劑量依賴性，其中尤以20μM、40μM效果最為顯著，見圖3（封四）。

3 討 論

SAHF是衰老細(xì)胞特有的異染色質(zhì)聚集現(xiàn)象，衰老細(xì)胞的核仁變大，DNA呈點(diǎn)狀聚集分布，是細(xì)胞衰老的一個(gè)新的生物學(xué)標(biāo)志。p16/Rb途徑、組蛋白H2A變異體macroH2A、高遷移率蛋白A（HMGA proteins）、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39（誘導(dǎo)H3 Lys9 （H3K9）三甲基化）、組蛋白去乙酰化酶HDAC1等均參與SAHF的形成[7-8]。

人參是我國傳統(tǒng)名貴中藥，有抗衰老、抗氧化、益智及保護(hù)神經(jīng)元免受毒性物質(zhì)損傷等作用。人參皂苷Rgl對神經(jīng)毒素誘導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞及動物模型均有抗氧化作用。Rgl通過調(diào)節(jié)p16/Rb、p21、cyclin D等細(xì)胞周期調(diào)控因子表達(dá)等機(jī)制發(fā)揮其抗細(xì)胞衰老作用[9-11]。本研究結(jié)果提示，人參皂苷Rg1預(yù)處理可劑量依賴性地預(yù)防神經(jīng)細(xì)胞衰老，防止異染色質(zhì)聚集。

本文采用t-BHP制備N2a細(xì)胞衰老模型，考察人參皂苷Rg1預(yù)處理對神經(jīng)細(xì)胞衰老的保護(hù)作用，采用CCK-8評價(jià)Rg1對細(xì)胞活力的影響，采用SA-β-gal染色考察Rg1對細(xì)胞衰老的影響，并探討Rg1 對SAHF這一較為新穎的細(xì)胞衰老分子生物學(xué)標(biāo)記的影響。CCK-8測試結(jié)果提示，人參皂苷Rg1預(yù)處理可劑量依賴性地改善t-BHP誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降；此外，隨著處理時(shí)間的延長，不同劑量組之間的改善效果差異加劇，如在24h、48h，20μM與40μM兩組吸光度值差異不明顯，但在72h時(shí)，兩者差異顯著。SA-β-gal染色結(jié)果提示，人參皂苷Rg1預(yù)處理可劑量依賴性降低陽性細(xì)胞數(shù)，表明人參皂苷Rg1可預(yù)防模型藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老，其中尤以40μM效果最為顯著。SAHF染色結(jié)果提示，人參皂苷Rg1預(yù)處理可預(yù)防t-BHP誘導(dǎo)的SAHF形成，且呈顯著劑量依賴性，其中尤以20μM、40μM效果最為顯著。以上研究結(jié)果表明，人參皂苷Rg1預(yù)處理可劑量依賴性地預(yù)防t-BHP誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老與SHAF形成。鑒于SHAF為一較為新穎的細(xì)胞衰老干預(yù)靶標(biāo)，有必要有針對性地深入探討其作用機(jī)制，為人參皂苷Rg1的臨床應(yīng)用提供更多的科學(xué)依據(jù)。

［1］Brettschneider J，Del Tredici K，Lee VMY，et al.Spreading of pathology in neurodegenerative diseases：a focus on human studies［J］.Nature Reviews Neuroscience，2015，16（2）：109-120.

［2］Tan FCC，Hutchison ER，Eitan E，et al.Are there roles for brain cell senescence in aging and neurodegenerative disorders［J］.Biogerontology，2014，15（6）：643-660.

［3］Yeh YC，Liu TJ，Lo JC，et al.Underlying mechanisms of tertbutyl hydroperoxide induced vascular cell dysfunction and senescence in rats：in vivo and in vitro studies［J］.The FASEB Journal，2012，26（1）：8408.

［4］Ji J，Tian Y，Zhu Y，et al.Ionizing irradiation inhibits keloid fibroblast cell proliferation and induces premature cellular senescence［J］.The Journal of dermatology，2015，42（1）：56-63.

［5］Baker DJ，Wijshake T，Tchkonia T，et al.Clearance of p16 Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders［J］.Nature，2011，479（7372）：232-236.

［6］Aird KM，Zhang R.Detection of senescence-associated heterochromatin foci（SAHF）［M］.Cell Senescence.Humana Press，2013：185-196.

［7］Banito A，Lowe SW.A new development in senescence［J］. Cell，2013，155（5）：977-978.

［8］Kocylowski MK，Halazonetis TD.SAHF，to senesce or not to senesce［J］.Cell Cycle，2011，10（5）：741-740.

［9］楊逸，楊麗瑛，戴景峰，等.人參皂苷Rg1藥理活性的研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2012，23（12）：3121-3123.

［10］Zhu J，Mu X，Zeng J，et al.Ginsenoside Rg1 prevents cognitive impairment and hippocampus senescence in a rat model of d-galactose-induced aging［J］.PloS one，2014，9 （6）：e101291.

［11］Chen L，Lin Z，Zhu Y，et al.Ginsenoside Rg1 attenuates βamyloid generation via suppressing PPARγ-regulated BACE1 activity in N2a-APP695 cells［J］.European journal of pharmacology，2012，675（1）：15-21.

（收稿：2015-09-15 修回：2015-10-29）

Effects of Ginsenoside Rg1 on Senescent Nerve Cells and Senescence-Associated Heterochromatic Foci

HANZhicun1,LIU Bing2,ZHOU Hui3. 1 Department of Tuina,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012), China;2 Laboratory of Basic Medicine,Zhejiang Province Academy of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou (310007),China;3 Department of Orthopedics,Hangzhou Chinese Medical University,Hangzhou(310007),China

ObjectiveTo investigate whether ginsenoside Rg1 prevents oxidative-stress-induced cellular senescence and senescence-associated heterochromatic foci（SAHF）in Neuro-2a cells.MethodsSenescent Neuro-2a cells induced by tBHP（t-butylhydroperoxide）were treated in advance with ginsenoside Rg1.Healthy Neuro-2a cells and senescent Neuro-2a cells without ginsenoside Rg1 pretreatment serviced as controls.Senescence-associated β-galactosidase（SA-beta-gal）activity,cell viability and SAHF were examined.Results In a dose-dependent manner,ginsenoside Rg1 enhanced cell viability,decreased the number of SA-beta-gal positive cells,and decreased SAHF formation.ConclusionGinsenoside Rg1 protects Neuro-2a cells from tBHP-induced senescence and decreases SAHF.

Neuro-2a cells;ginsenoside Rg1;cellular senescence;senescence-associated heterochromatic foci

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.Y2100169）

1浙江省立同德醫(yī)院針灸推拿科（杭州 310012）；2浙江省中醫(yī)藥研究院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)所（杭州 310007）；3杭州市中醫(yī)院骨傷科（杭州 310007）

劉冰，E-mail：gene112@163.com